蛋白质(或多肽)的放射性标记及分析方法.ppt
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1、第二部分 核素示踪技术在分子生物学研究中的应用,分子生物学是一门新兴边缘学科,它跨越了遗传学、细胞生物学、有机与无机化学、生物化学、物理学、生物物理学等许多学科,是当代数、理、化科学广泛深刻地渗入生物学而形成发展起来的。其中,核素示踪技术在其中起着里程碑性的重要作用。一、35S和32P双标记噬菌体感染实验证明DNA是遗传信息的载体1952年,Hershey和Chase用大肠杆菌的T2噬菌体繁殖实验,证实了从噬菌体颗粒注入到细菌中去的DNA含有繁殖后代噬菌体所需的全部信息。T2噬菌体颗粒由蛋白质外壳包裹的DNA(单链)核所组成。在DNA核与蛋白质外壳中,只有DNA含有磷原子,只有蛋白质中的甲硫氨
2、酸和半胱氨酸含有硫原子,把T2噬菌体放在以放射性磷(32PO43)为唯一磷源和以放射性硫(35SO42)为唯一硫源的培养基中培养时,即可获得32P标记的DNA和35S标记的蛋白质的噬菌体。用这种双标记的噬菌体去感染大肠杆菌寄主,结果发现只有32P标记的DNA注入到寄主细胞内部并繁殖出具有蛋白外壳的子代噬菌体。在这些子代噬菌体中,有少量的DNA带有标记32P,但没有一个蛋白外壳带有标记35S。证实了DNA是遗传信息的携带者。,二、15N,14N标记E.Coli繁殖实验证明双链DNA具有半保留的复制机制 1957年,Meselson-Stahl用放射性标记技术,实验证明了Watson与Crick提
3、出的双链DNA半保留复制理论。在半保留复制中,亲本双链DNA的两条链分开,它们根据碱基配对原则各自以自己为模板,选取适当的碱基组成两条子代双链,完成复制过程。实验是这样进行的:先使细菌培养物(EColi)在以15N标记的15NH4C1为唯一氮源的培养基中生长许多代,使DNA分子都标记上重同位素15N。再把细胞转移到含普通同位素15N的培养基上。在转移后不同时间收集细胞样品,提取DNA并作CsCl密度梯度离心。结果发现有密度介于重的15N,14N和轻的15N,14N DNA之间的杂化分子15N,14N DNA出现。这种杂化分子随着培养时间的增加逐渐增多。当培养到ECo1i繁殖第一代的时间时,杂化
4、分子成为主要成分。尔后即有轻的15N,14N DNA分子出现。当培养到EColi第二代时,杂化DNA与轻DNA各占一半。取杂化DNA分子在100下作热变性处理后于CsCl中离心,可以出现两条区带,它们分别为14N单链DNA和15N单链DNA。Meselson-Stahl实验证实了E.Coli繁殖中,亲代DNA分为两条单链,各自成为子代双链DNA的模板,双链DNA具有半保留复制机制。,三、32P标记分子杂交实验证明遗传信息从DNA到mRNA的转录 Spiegelman利用人工合成RNA-DNA杂种分子的实验证明RNA分子的核苷酸顺序由DNA转录决定,RNA分子的生物信息来自DNA。把双链DNA加
5、热,使产生单链DNA分子,若在热溶液逐渐冷却过程中加入与该DNA链互补的单链mRNA,则在形成复性DNA分子的同时会有DNA-RNA杂种分子形成。形成杂种分子的条件是这种RNA分子的核苷酸顺序与DNA分子中某些核苷酸顺序互补。利用这个原理,可以鉴别RNA与DNA碱基顺序是否有互补的特性。实验也可采用放射性标记技术进行。将T4噬菌体感染的大肠杆菌(EColi)放在含32PO43的培养基中培养,提取32P标记的RNA,将32P-RNA分别加到EColi的DNA热溶液和T4噬菌体的DNA热溶液中,溶液慢慢冷却后上膜过滤,除去游离RNA,测量膜上物质的32P放射性活度。结果发现加到T4 DNA溶液中的
6、32P-RNA大部分已和T4 DNA形成杂交分子并留在膜上,而加到EColi DNA溶液中的32P-RNA很少与EColi DNA形成杂交分子因此很少留在膜上。这个实验证明了感染后合成的RNA和噬菌体DNA的碱基顺序互补,前者的碱基顺序由后者决定,同时感染后合成的RNA并下与宿主细胞DNA互补。这个结果和关于噬菌体DNA是合成噬菌体mRNA的模板这一早期推测完全一致。,四、3H-亮氨酸标记网织红血球培养实验证明多肽链合成起始于氨基末端 多肽链是从氨基末端还是从羧基末端开始延伸的,Dintzis的放射性标记实验作出了回答。把网织红血球加3H标记的亮氨酸3H-Leu作体外培养,蛋白质合成后分离提取
7、出新合成的血红蛋白,分析该蛋白肽链中的放射性分布。实际上,如果培养的时间相对较长时(如3min),那么在合成的肽链中,有一些是在加入3H-Leu前已接近完全合成的,这些肽链中只在远离生长点的地方有3H-Leu;另一些肽链是在加入3H-Leu后才开始合成的,这些肽链几乎整条链上都分布有3H-Leu还有更多的肽链一段在3H-Leu加入前另一段在3H-Leu加入后合成,且长短不一。这样,血红蛋白链有如图7-2所示的3H-Leu分布。如果培养的时间很短(如30s),则只有在3H-Leu加入前已经合成了某一片段的那些链,才有可能完成整个链的合成。故靠近某一端的3H-Leu放射性比另一端强许多(图7-2
8、H p448)且有一定的梯度分布。实验表明,血红蛋白肽链中靠近氨基末端的放射性比活度最低,靠近羧基末端的则最高,从而证明肽链的合成是由氨基端到羧基端的方向延伸的。,五、14C标记氨酰基tRNA对三联体遗传密码的研究 蛋白质是一类按一定顺序排列起来的氨基酸所组成的多肽结构,它的生物合成过程是mRNA密码信息经核糖体解译的转译过程。放射性标记实验技术在了解这个遗传密码的解读上也有重要作用。实验原理如下:由A,U,G,C四种核糖核苷酸中的三种人工合成某一种三核苷酸,取20种氨酰基-tRNA中的一种用14C或3H标记,使该三核苷酸与19种非标记及1种标记的氨酰基-tRNA以及适当的核糖体组成一个反应系
9、统。三核苷酸代表mRNA上的一个三联体密码,使相应的氨酰基tRNA结合到核糖体上。反应结束后看哪一种标记的氨酰基-tRNA可被结合,定出该三核苷酸密码与哪一种标记的氨酰基-tRNA有对应的结合关系,从而可以确定mRNA上三联体密码子在转译成蛋白质中的意义。,本部分主要内容:第七章 蛋白质(或多肽)的放射性标记及分析方法;第八章 同位素示踪技术在DNA序列测定中的应用;第九章 放射性核酸探针的制备及其应用。,第七章 蛋白质(或多肽)的放射性标记及分析方法,一、蛋白质(或多肽)的放射性标记方法在现代生物和医学的研究和应用中,需要将胰岛素等具有生物活性的蛋白质(或多肽)进行特异性的标记,以研究它们在
10、生物体内或离体状态下的生理生化特性及功能与作用机制等。目前主要的标记类型有:放射性标记 酶标记 荧光标记 化学发光标记。蛋白质(或多肽)的放射性标记,目前主要有:化学标记法 生物合成标记法,1、化学标记法(1)125I标记 125I的半衰期为60天,衰变方式为电子俘获(EC),能量为35 kev。为了叙述方便将方法具体化,我们主要以胰岛素的125I标记为例。胰岛素分子是有A,B两条多肽链组成的,分子中共用4个酪氨酸残基,即A14、A19、B16和B26酪氨酸。在没有-SH存在的氧化条件下,125I可置换酪氨酸残基苯环上羟基邻位的氢原子,使之碘化为单碘或双碘酪氨酸。因胰岛素分子中4个Tyr都可以
11、发生此反应,使A14、A19、B16和B26中被碘化的Tyr不只一个。但研究表明,单碘胰岛素比双碘胰岛素具有更高的免疫活性。生物学家、放免学家、医学家和实验内分泌学家在制备单碘胰岛素上作了各种方法学的探索。由于碘化方法不同,对胰岛素的碘化情况也不尽相同。,氯胺T碘化法(CT法)A、原理 放射性碘可参与到蛋白质酪氨酸残基上,形成单碘或双碘Tyr。Na125I的碘是负离子(I-),只有正碘离子(I)才能取代Tyr苯环上与羟基邻位(3位或5位)的质子。因此,反应需加氧化剂。氯胺T(学名:氯胺赶对甲苯磺酸钠)就是一种催化剂,它可从负碘离子上移去一对电子,使之转变成正离子(I-I)或125I碘化反应几乎
12、在瞬间完成。标记的蛋白质用凝胶过滤等方法提纯。反应式如下:,B、操作方法 取胰岛素液10 l(5 l),0.4 mol/L,pH 7.4磷酸缓冲液50 l,Na125I液7.4107 Bq氯胺T液10 l(100 g)。混匀反应1-3 min。加入偏亚硫酸钠(Na2S2O4)液100 l(250 g)(还原过剩的氯胺T),终止反应。反应混合物一般用Sphadex G25或其他柱层析法脱盐得到的标记物是4种单碘胰岛素和双碘胰岛素的混合物。分离方法各种碘标胰岛素(将在下面介绍)。Freychet和Linde等人以大鼠脂细胞来测定氯胺T法标记的胰岛素的生物活性,发现仅为天然胰岛素的60-70%。,C
13、、优缺点 优点:简单、快速。缺点:由于终止反应时,所用的还原剂偏亚硫酸纳的浓度太高,对蛋白质中的二硫键会产生还原作用;标记时,虽然蛋白质分子暴露于氯胺T下的时间很短,但蛋白质分子还是可被氧化脱羧和脱氨。因此,这种碘化反应难以控制,会出现较多的双Tyr取代蛋白质或双碘蛋白质,以及较多的损伤蛋白质,而使产物的免疫活性及生物活性都达不到受体分析的要求。同时,还原剂可能残留于标记物中,使其保存(有效)期较短,一般只有11.5个月。,酶促碘化法 70年代人们开始用酶标记法,此法可避免氧化剂与蛋白质分子直接接触。基本原理:将氧化型的125I-结合于酶分子上,形成“酶125I”复合物,然后在酶的催化作用下,
14、将125I转移到蛋白质的Tyr残基上。酶标法得到的产物,标记损伤可大大减少,反应条件也较易控制。主要有三种:,A、辣根过氧化物酶碘化法(Horseperoxidase,HPO法)辣根过氧化物酶能与125I形成酶碘化合物,H2O2由葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生,当I/胰岛素的比值为1.0时,标记产物中单碘胰岛素约占99%。其中A19占98%,A14、B16和B26单碘化合物均小于1%。比活度可达4.4106 Bp/ug左右。几乎只产生一种单碘化合物,即A19单碘胰岛素,是HPO法的优点。已知A19-Tyr在胰岛素单体上位于表面一个不变的区域。这个区域被认为是胰岛素受体结合的区域。这可以解释HPO法
15、所得到标记化合物以A19单125I-胰岛素为主的现象。但随着I/胰岛素比值的增加,A14、B16和B26单碘标记率也随之增加;此外,B16和B26残基位于同一表面区域,在HPO法中,B16和B26单碘化合物却很低。此说明,HPO将125I转移到Tyr残基上的过程,除了接触Tyr的难易程度和空间位置外,还包括酶促作用的选择性。详细机理至今不甚明了(涉及到蛋白质构象问题)。,B、乳过氧化物酶碘化法(Lactoperoxidase,LPO法)1971年Ferychet等人首先采用此法,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离标记混合物,得到了A14和A19两种单碘胰岛素。标记方法如下:取Na125I 37107/
16、1030 l、磷酸缓冲液(PBS)(0.250.5 mol/L,)10 l、胰岛素10 g/10 l、H2O2 50 g/10 l、LPO 1 g/5 l混合,反应5 min,加40%蔗糖4050 l混合,上凝胶柱电泳。在中性条件下,乳过氧化物酶可与125I形成“酶-125I”复合物,然后将125I转移到Tyr残基上。此法与HPO法相似,但不同的是,LPO法所得到的单碘胰岛素中,A14含量较高,可占所得单碘胰岛素的3570%;A19标记物比HPO法少。A链单碘胰岛素占全部标记物的9899%,B链单碘标记物仅占12%。LPO法较简便,省时,得到的A14单碘标记物较多,宜作受体分析。,C、LPO-
17、葡萄糖氧化酶碘化法(Lactoperoxidase-Glucose Oxidase:LPO-GO)由于在LPO碘化法中,H2O2是直接加入的,因此对蛋白质(或多肽)的损伤较大。1977年,Tower等人用葡萄糖氧化酶在溶液中催化氧和-D-葡萄糖,使之连续不断的产生少量的H2O2。这比直接加入H2O2易于控制,避免H2O2太多和局部浓度太大对蛋白质或多肽分子中二硫键和色氨酸,胱氨酸等的损伤太大,从而减少标记损伤,使125I化的蛋白质或多肽能保持良好的生物或免疫活性。,联结碘化法 这是近年来常用的蛋白质碘化法。它是通过末端氨基与碘化试剂形成肽键而完成蛋白质的标记。碘化试剂有:碘苯胺、甲基-对-羟基
18、苯亚胺脂、碘化对氨基苯磺酸、二磺荧光素和Bolton-Hunter试剂(学名:3-(4-羟基苯)-丙酸琥珀酰亚胺脂)。其中以Bolton-Hunter试剂用的最为广泛,它是N-羟基丁二酰和碘化对羟基丙酸形成的脂,可在实验室从N-琥珀酰3-(4-羟基苯)-丙酸盐合成。须注意:Bolton-Hunter试剂在水中很容易失活,酶促法显著减弱其活性,而Bolton-Hunter试剂对活性毫无影响。,固相碘化法 IODOGEN是近年来发展起来的一种固相125I化标记试剂。名称1,3,4,6-四氯-32,62-二苯基甘(代)联脲(1,3,4,6-Tetrachloro-32,62-diphenlglyco
19、uril)。1978年Fraker和Speck首次介绍用IODOGEN对蛋白质和细胞膜进行125I标记。IODOGEN不溶于水,故可以固相形式参与蛋白质的碘化过程。以后相继报导用IODOGEN碘化标记大肠杆菌核糖体蛋白质、家兔网织细胞核糖体蛋白质、仙台病毒、人生长激素和促甲状腺素、人细胞和组织培养的细胞、大鼠纤维蛋白质和人纤维蛋白质等。下面介绍利用IODOGEN 125I标记方法标记经去污剂Sarkosyl NL-97裂解的甲型流感病毒的基本过程。A、IODOGEN固相的制备 IODOGEN 1 mg溶于1 ml氯仿中,取10 l加入1275 mm玻璃试管中,室温下在通风橱内用氮气气流将溶剂挥
20、发,待彻底干燥后即可用于标记。B、流感病毒的裂解 纯化的甲型流感病毒X-31(H3N2)50 g,悬浮于100 ml STE(PH 8.0)中,加入25 l 10%Sarkosyl NL-97,37温育15 min。,C、碘化反应 用STE(0.15M氯化钠、10 mM Tris、1 mM EDTA、PH 8.0)充分洗涤。已制备好的IODOGEN固相反应器,以除去管壁上附着不牢固的IODOGEN。将已裂解的病毒悬浮液加入管内,随即加入125I-NaI 0.5 mCi(110 mCi/ml),室温下反应30 min,间或轻轻震荡试管,以增加病毒和125I-NaI与固相IODOGEN的接触机会。
21、吸出管内全部液体,则反应自行终止。以葡聚糖凝胶G-50柱层析除去未标记游离碘。标记病毒的放射性可达310 mCi/mg蛋白。D、对IODOGEN碘化法的评价 此法非常简便有效。碘化反应可在037下进行,反应不受去污剂、变性条件或酶抑制剂的影响。样品从反应管取出后反应即终止。样品可直接进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。因此非常适合于蛋白质体标记。IODOGEN固相管一次可制多个,并能在室温下长期保存。在SDS或Sarkosyl NL-97等变性剂存在下,IODOGEN能有效的标记各种蛋白质或多肽,所获得的放射性活度一般高于氯胺T法。,(2)3H和14C标记 甲基化反应和烷基化反应 蛋白质的赖氨酸(
22、或末端)氨基可与甲醛和硼氢化物发生还原甲基化反应:Pro-NH2+2 HCHO+1/2 NaBH4 Pro-N(CH3)2+1/2 Na H2BO3+1/2 H2O因此,用3H或14C-甲醛或3H-硼氢物可标记蛋白质。按每个氨基加上两个甲基计算,用14C-甲醛可得比放射性为5106 dpm/mg的标记蛋白质,相当于最大理论值的20%。用3H-硼氢物标记蛋白质,其比放射性可达3.5108 dpm/mg蛋白质,比氯胺T碘化法高。NaHB4在水溶液中易分解,这种分解在碱性PH值较慢,在室温pH 9时,其T1/2也只有10 min;在pH 8则仅1 min左右。氰基硼氢化钠在水溶液中稳定,用它代替Na
23、HB4,反应可在pH 7条件下进行,这有利于某些不稳定蛋白质的标记。此外,在蛋白质的多种残基,如半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸和赖氨酸的侧链上,很容易引入羟甲基。d-卤酸盐,如碘乙酸钠或溴乙酸钠是常用的烷化试剂。利用3H或14C烷化试剂可标记蛋白质。,3H和1H的交换反应溶剂中的3H可与肽键和一级胺上的1H交换。利用这个反应可将3H标记在蛋白质上。交换法简便,反应条件温和,不损伤蛋白质活性。但因交换法反应是可逆的,标记原子可迅速回到溶液中9比如2小时内可减少到25%)。因此,用这种方法标记的样品应及时进行分析和测定。,(3)金属蛋白(Metalloproteins)中金属原子的标记生物体内有一些含金
24、属原子的蛋白质(酶),它们在生物体内起着非常重要的作用。如固氮酶的两个组分中,Fe蛋白是一种Fe-S蛋白,MoFe蛋白是由两种不同的亚单位组成的四聚体,并含两个络合和还原底物的Fe MoCo与两个可能起传递和贮存电子作用的、由双Fe4S4组成的P-cluster。因此MoFe蛋白是含金属Mo、Fe的酶。自然界中还存在分别以V和Fe取代Mo(第一固氮酶体系)的第二、第三固氮酶体系。这些事实表明可固氮酶在所含金属种类方面具有生物多样性。目前,许多金属原子和生物大分子的结构和功能的关系还不很清楚。同位素示踪技术是进行此项研究的重要手段之一。下面我们主要以99Mo标记Mo Fe蛋白为例,进行这方面的探
25、讨。其化学标记主要有拆卸与组装法。先将蛋白质中的金属部分在某种条件下拆卸下来,使之与多肽链分离,再用带放射性的重组液与这种多肽链在一定条件下重组,将金属部分进行重心组装而后标记。例如,用邻菲啰啉和氧或尿素可将Mo Fe蛋白中的P-cluster和Fe Mo Co部分或全部拆卸下来而得到不全蛋白(apo-protein),再用含99Mo、Fe、S的重组液与apo-protein重新组装金属原子簇,从而使重组的Mo Fe蛋白带上99Mo的标记。,*棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)野生型固氮菌含钼固氮酶的基本结构 固氮酶是一种由两种组分蛋白组成的金属酶。棕色固氮菌含钼固氮酶
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