蛋白样本制备、定量及western步骤详解.ppt

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1、蛋白样本制备与Western Blot,http:/,Company Logo,主要内容,Company Logo,一 蛋白样本制备-成功蛋白分析的基础,蛋白样本,immunoblotting,mass spectrometry,蛋白样本制备的目的:后续应用,Company Logo,二 蛋白样本制备的原则,蛋白样本制备原则,方法应具备标准化，具有重现性、可靠性、简便性；,尽量抽提完全；,应使所有蛋白全部处于溶解状态,防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性,防止在抽提过程中发生化学修饰,如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白,必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。,Company Logo,二 蛋

2、白样本制备的策略,制备蛋白的目的活性分析 免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀1D 2D EMSA CHIP等,实验材料 细胞 组织 固定组织或石蜡包埋组织 微生物 酵母 植物 提取RNA后的剩余的蛋白样本等,目的蛋白的结性质与分布分布于胞桨/胞核/膜 可溶/不可溶 含量多少 分子量大小 四级结构特征 磷酸化等修饰,方法的选择 1 自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取 2 购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取,Company Logo,三 案例分析-细胞中总蛋白的制备,Company Logo,细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点,Company Logo,细胞裂解液-RIP

3、A Buffer的配方分析及技术要点,Company Logo,细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点,Company Logo,各类表面活性剂特点,1 阴离子型:SDS 脱氧胆酸盐 2 阳离子型:CPB和CTAB 3 双性离子型:CHAPS Zwittergent系列 4 非离子型:Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等,Company Logo,选用表面活性剂考虑的因素,参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂,选用表面活性剂考虑的因素,工作条件下表面活性剂的溶解性,使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等,根据样本下游的应用

4、来选择表面活性剂的种类,考虑表面活性剂的去除方法,表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量,保护蛋白活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度,尽量使用毒性较低的表面活性剂,因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离,使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性,有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进行蛋白的后续分析,Company Logo,去除未结合的表面活性剂,根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目,和电荷等性质来去除.,Company Logo,细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点,C

5、ompany Logo,蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒,Company Logo,细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点,Company Logo,磷酸酶抑制剂选择,磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：PP1,PP2A,PP2B）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。常规的抑制剂主要包括：,Company Logo,细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点,Company Logo,细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点,Company Logo,全蛋白抽提时注意事项,Company Logo,

6、细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点,Company Logo,四 蛋白样本制备产品选择指南,Company Logo,核蛋白样本制备,抽提原理低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与胞核;离心分离出胞核;高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解DNA,释放出DNA结合蛋白(组蛋白和转录因子)实验注意事项试剂和器皿冰上预冷裂解液的用量细胞总量抑制蛋白酶蛋白酶抑制剂,Company Logo,膜蛋白样本制备,Company Logo,膜蛋白的抽提,方法及原理方法多 直接抽提法 分级抽提法 1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提 2:按溶解性分级抽提 3:按亚细

7、胞分级抽提 产物细胞膜蛋白细胞器质膜蛋白注意事项根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂变性剂等.抑制蛋白酶.样本量,Company Logo,膜蛋白的直接提取,Company Logo,蛋白的分级提取,按蛋白溶解度不同进行分级抽提,降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白(膜蛋白)；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。,Company Logo,亚细胞分级抽提,用超离心技术分离出细胞器、质膜和细

8、胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。根椐胞浆/胞膜/胞核/骨架蛋白的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解,Company Logo,四种亚细胞组分分离提取的结果,Company Logo,线粒体蛋白样本制备,首先用密度梯度离心方法分别分离出线粒体,胞质,胞核.再用线粒体抽提Buffer溶解线粒体蛋白.,Company Logo,其它蛋白抽提产品,高丰度蛋白去除试剂盒信号蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒,Company Logo,五 蛋

9、白定量产品选择指南,Company Logo,BCA法蛋白定量,BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和

10、脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。,Company Logo,Bradford法蛋白定量,考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

11、由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。,Company Logo,Lowery法蛋白定量,Lowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式

12、，且专一性较差，干扰物质较多。,Company Logo,六 成功的Western Blot,Diagram,通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白,原理,Company Logo,六 成功的Western Blot,Company Logo,蛋白变性,Tris-cl(PH 6.8)SDS Glycerol Bromphend-blue-巯基乙醇 DTT,高温变性,形成蛋白质-SDS胶束,

13、急速冷却，防止复性,加入Sample buffer,沸水浴15min,冰浴30min,Company Logo,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,产物：三维网状结构凝胶,Tris-Cl,四甲基乙二胺（TEMED）,丙烯酰胺（Acr）,过硫酸胺或核黄素（AP）,甲叉双丙烯酰胺（Bis）,Company Logo,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳缓冲液：PH8.3Tris-甘氨酸-SDS系统。,Company Logo,SDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围,不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。,Company Logo,聚丙烯酰胺分离胶配方,Company Logo,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,灌

14、制分离胶 隔绝空气,灌好后一般室温放置3040分钟,Company Logo,SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方,Company Logo,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,灌制积层胶 插入梳子,Company Logo,SDS-PAGE胶制备注意事项,过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放置23天。配制30丙烯酰胺储存液要过滤。配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。要根据温度调整TEMED的使用量。水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。插梳子的时候要用力均匀，一次成型。在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道中的杂质。,Company Logo,上样及电泳,提

15、前将样品沸水浴5分钟，1200014000rpm离心5分钟。根据自己的设计上样。80V恒压跑浓缩胶。看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为100V。当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.40.6mm时停止电泳。,Company Logo,转膜,蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。,Company Logo,转膜,Company Logo,转膜注意事项,PVDF膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除去中间的气泡。然后在转膜也中平衡20分钟。膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方就会断路，蛋白无法转到膜上。转膜要在冰浴中进行，防止散热

16、量太大导致转膜温度过高。根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。,Company Logo,膜的封闭,为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理,一般用5的脱脂奶粉或者3的BSA室温或37度封闭2小时。,Company Logo,转好蛋白的膜,Protein,Protein,Company Logo,封闭,Protein,Protein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,Company Logo,一抗孵育,Protein,Protein,Blocking Agent,Blo

17、cking Agent,Blocking Agent,Primary Antibody,Company Logo,二抗孵育,Protein,Protein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,E,E,Primary Antibody,Secondary Antibody,Company Logo,显影,Protein,Protein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,E,E,Primary Antibody,SecondaryAntibodyEnzyme(E),s,s,s,s,s,P,

18、P,P,P,Substrate,Company Logo,显色方法-HRP酶促底物直接显色,Company Logo,显色方法化学发光,Company Logo,成功的要素,质优量足的蛋白样本科学的对照正确的抗体选择 保存和使用细致的实验操作步步监测,Company Logo,科学的对照,蛋白Marker：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取物，用于检验抗体的特异性二抗对照：不加一抗，用

19、于检验二抗的特异性内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果,Company Logo,蛋白Marker,Company Logo,WB常用内参及其技术参数,antibody AC-15(ab6276)at 1/5000 dilution,Lysates/proteins at 20 ug per laneLane 1:HeLa nuclearLane 2:HeLa whole cell lysateLane 3:A431 cell lys

20、ateLane 4:Jurkat cell lysateLane 5:HEK293 cell lysate.,Company Logo,正确的抗体选择 保存和使用,一抗的选择:1、样本的种属 2、适用于WB实验方法 3、单克隆抗体 经亲和纯化的多克隆抗体二抗的选择 与一抗种属匹配 HRP标记的 重链轻链 全长的、Fab段的以及Fc段的抗体的保存和使用：1、按说明书的要求分装保存；避免反复冻融 2、工作液现配现用，4度不超过2周 3、说明书推荐的稀释倍数作参考，提前一个月预订,Company Logo,实验细节,电泳:变性与还原 SDS的质量 胶的浓度 上样量转膜:湿式 半干式 蛋白大小与电转液

21、SDS和甲醇的比例 膜的种类 PVDF NC 尼龙膜 膜的预处理:尺寸同胶 充分浸透 杜绝气泡 防止干燥封闭 脱脂奶粉与BSA的选择 以TBST配制 封闭液需过滤 封闭41小时 封闭与洗膜时间 按抗体说明书提示使用的特殊的封闭剂,一抗孵育 抗体释释液(TBST或封闭液)及稀释倍数,尽量采用低浓度抗体和较长的孵育时间(过夜)孵育温度:4,轻摇二抗孵育 抗体释释液(TBST)及稀释倍数 室温 1-2小时,轻摇 标记HPR底物压片曝光 ECL试剂盒 压片时间,Company Logo,步步监测,蛋白样本 定量和SDS-PAGE考马斯蓝染色SDS-PAGE电泳 凝胶铜染监测转膜 丽春红染色监测一抗 阳性对照 阴性对照二抗 二抗对照封闭与洗膜 内参对照 空白对照半定量 内参对照压片 底物直接显色实验体系 内参与阳性对照,Company Logo,问题分析1,Company Logo,问题分析2,Company Logo,问题分析3,Company Logo,问题分析4,Company Logo,Thank You!,