干细胞技术服务.ppt

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1、,干细胞产品技术服务,OricellTM,OricellTM,最新产品：,1.ES成神经元分化试剂盒；2.ES成心肌分化试剂盒；,3.ES成肝实质细胞分化试剂盒；4.MSC成肝实质细胞分化试剂盒；5.NSC成神经元分化试剂盒；,6.NSC成星型胶质细胞分化试剂盒；,目录：,胚胎干细胞培养和技术介绍,成体干细胞的常见问题与解决方案,1.细胞和培养（干细胞、原代细胞产品和试剂）2.细胞分化（多个方向的标准方法）3.细胞示踪（GFP/RFP 和定制方法）,干细胞冻存和复苏方案干细胞应用技术,Stem cell,间充质干细胞（MSC）,Mesenchymal Stem Cells是一种多能干细,胞；,

2、胚胎干细胞（ES）,Embryonic Stem Cells是一种全能的干细,胞,神经干细胞（NSC）,Neural Stem cell是一种神经系统的多能干,细胞,Primary cell,神经元系统（多个来源和物种，海马、皮层）星型胶质细胞（多个物种皮层）肝实质细胞；,肝脏前体细胞；,分离其他客户定制细胞；,胚胎干细胞,胚胎干细胞,胚胎干细胞(embryonicstemcellES,细胞)是指胚泡期的内细胞团中分离出的尚未分化的、能在体外培养、具有发育全能性的早期胚胎细胞无限增殖、自我更新,可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型,ES细胞的来源：5d 胚胎,ABC D,ES生长特性,鼠：

3、生长快，胰酶消化，2天传一次，可一传多。,复苏率较高。,人：生长慢，机械分离，710天传一次，相,对较少。1:41:6。,复苏率低。,表面抗原的表达,Oct-4：一种转录因子，发育全能性的标志。,碱性磷酸酶（AKP）：常被用来作为鉴定ES,细胞及其分化与否的重要标志。,SSEA-1：小鼠ES表达,SSEA-3、SSEA-4：人ES表达,染色体结构,核型分析：正常稳定的二倍体核型。不随传代次数而改变。,46，XX；46，XY,核型检测：46，XX,多能性和全能性体内：畸胎瘤实验特定抗,拟胚体,特定条件诱 体免疫导/自然分化 组化,体外分化,去除饲养层细胞,全能性,体内：畸胎瘤实验,体外：去除饲养

4、层细胞,拟胚体（EB,embryoid body。为ES 细胞悬浮,生长自发分化形成,含有内中外三个胚层组织,能基本上模拟体内的发育过程)；贴壁诱导；,特定条件诱导/自然分化（除去LIF）各胚层特定抗体免疫组化检测,体内：畸胎瘤检测,血管组织呼吸道上皮,鳞状上皮,腺体组织脂肪组织,体内分化,外胚层：鳞状上皮、神经组织等,中胚层：骨和软骨、横纹肌、骨骼肌、血细胞和骨髓细胞等内胚层：柱状上皮、肠管样组织等,体外：分化形态,ES贴壁诱导,EB约57天后出现自主性搏动,129 Mouse,Human ES,免疫组化检测,Nestin(ectoderm)Troponin(mesoderm),Tubuli

5、n(ectoderm)AFP(endoderm),神经分化：贴壁诱导第2天,神经分化：贴壁诱导第5天,IHC3Tublin,特异性抗原的表达情况,抗原人ES鼠ES,Oct-4+,Nanog+,SSEA-1+,SSEA-3+,SSEA-4+,不断有新的蛋白标记被发现和论证,碱性磷酸酶染色,小鼠ES流式图,染色体结构,核型分析：正常稳定的二倍体核型。不随传代次数而改变。,人（46，XX），鼠（40，XY),性别分析,性别通过PCR的方法鉴定，目的基因是基因组,DNA的Y染色体相关基因Tspy，阳性对照用X,染色体相关基因PolA1以及Gapdh。,ES Clone,mES-GFP,HumanES-

6、GFP,MEF 细胞：ES成功的一个重要因素,Cyagen提供的MEF经过-irradiation 处理，,确保所有的细胞都完全失去增殖能力，又可以保证最佳支持和分泌能力，同时没有任何化学有毒物质的污染，为你ES细胞提供最佳的生长环境；为ES的增殖提供多种因子；,实验室的调查普遍结果：,据Cyagen 对多个实验室使用的53个ES细胞,的样品进行检测，45%被支原体污染；,没有严格质量控制和环境控制的情况下制作的,MEF：有35%以上是携带支原体，这个数据,还根据操作技术不成熟，使用动物污染严重情况，风险也会大大的增加；,丝裂霉素C（MITOMYCINC）：,A、长期接触丝裂霉素C，药物毒性将

7、严重影响操作人员的身体健康；（单位量1030ug/ml处理20个10cmdish需要36mg）,B、丝裂霉素C溶液的不稳定，4保存，也会快速降解，导致处理的细胞不能完全失活，这将严重影响后面实验分析；,C、丝裂霉素C的残留，微量的丝裂霉素C也会造成ES细胞增殖抑制和分化；（因为其是细胞内DNA结合剂）,OCT-4(+)SSEA-1(-)SSEA-4(+),AAA,BBB,CCC,Es细胞培养的过程：,如何准备状态良好的MEF细胞；消化传代过程；,如何去除MEF细胞；挑克隆的操作；,如何准备用于进行各种基因操作的细胞；如何准备用于进行注射的细胞；,如何准备状态良好的MEF细胞；,取胚胎（13.5

8、d）：去除头部和四肢；,剪碎后加入0.125%胰酶进行消化到组织块基本消失；,终止消化并离心收集细胞；（检测细胞支原体）重悬接种：5000-10000cells/cm2第二天换液后培养3天，进行-射线照射；冻存检测；,生产过程控制：,动物：胚胎的孕龄；动物的污染物；细胞的支原体；,细胞的支持能力；细胞的失活；,蛋白表达检测；,合适的MEF的密度：,细胞的贴壁效率；细胞的分泌能力；细胞的大小；,最佳的密度受到很多因素影响：25000cells,过密：克隆生长缓慢，克隆小，但是立体感好；过稀：克隆容易分化，边缘不清晰，但是克隆增殖稍快；,最佳的密度：克隆边缘清晰，细胞容易增殖，大小均一。,如何去除

9、MEF：,无饲养层培养：但是代数非常有限，基本不能长期传代；,MEF培养：可以长期培养，细胞的状态好，不,影响细胞的全能性；,原理：利用不同细胞的贴壁的时间差异；,步骤：消化后离心重悬，在包被明胶的皿上贴壁,30min，轻轻吸出上清，接入另外一个包被有,明胶的皿中30min，再吸出上清中的细胞；并在包被的皿上培养一段时间，就可以去除大部分的MEF细胞；,影响因素：,克隆的状态：分化的细胞的贴壁性会大大增加；,MEF的状态：MEF如果有大量的碎片也会增加,液体的粘稠度干扰细胞的正常分离；,消化的效果：如果有MEF没有和ES很好的分开，会将ES一起贴在皿上；,细胞团和颗粒：颗粒大细胞团会导致细胞快

10、速沉淀并导致细胞贴壁；,如果效果不佳可以进行多次的重复，但是会大大减少细胞的回收率；,ES细胞的传代：,细胞的克隆出现足够大，细胞的边缘开始出现不清晰，细胞的克隆出现部分分化的情况；一般的周期是3-5天；,传代比例依据细胞的克隆大小和细胞的生长状态，比例为1：5-1：10；,消化的时候观察一般以MEF为标准，如果MEF基本上已经开始脱壁就可以终止消化；,挑克隆技术：,当克隆大部分出现分化的时候；克隆大小不均并且生长缓慢；注意事项：,拉针（要注意末端的大小）或使用1ml的注射器；,在体视镜下操作，要在解剖超净台中操作；注意环境，避免污染；,提取的克隆要消化后才能进行接种；单克隆的培养周期长，要更

11、有耐心；,用于ES囊胚注射的细胞控制：,低代数：（细胞的全能型和基因变异和染色体变异）,低分化程度：（细胞分化会大大影响细胞最后的整合的效率和生殖遗传的比例）,最低的控制标准：正常的核型，细胞的各种分化蛋白没有表达，各种ES的正常表达蛋白正常；具有成瘤性；增殖速度快；无任何外源污染；,其他类型的成体干细胞,间充质干细胞神经干细胞,间质干细胞是目前研究最多的干细胞,来源研究方向：不断有文章报道从不同的组织分离出MSC，整体方向是有利临床广泛取材和减少病人痛苦；,与组织工程结合的研究方式，最重要是如何提高与组织的相容性和提高在向多个方向分化的控制，如何成为一个真正的组织；,临床治疗研究，也是目前细

12、胞治疗的研究热点，国内主要的治疗细胞；,基因研究的载体，干细胞分化机制模型；,Cyagen能够提供协助：,来源研究：基本上从体内的各个组织中发现非常多的干细胞，包括肌肉，肺部，肌腱，血管，皮肤等，而这些细胞都具有含量非常少，同时也具有非常明显的组织特意性，表达非常多的组织特异性的蛋白；（提供高难度提取服务）,组织材料学：结合纳米材料和其他生物学材料，用于研究具有临床前景的材料；（细胞相容性，蛋白表达，细胞分化分析等）,临床研究：如何从单一来源获得大量稳定而且维持良好的生物学特性的细胞，同时保证生物的安全性；（提高全套的技术支持和服务）,间质干细胞,定义：来源于中胚层的早期细胞，能够分化为多种中

13、胚层和神经外胚层来源的细胞。,来源组织：骨髓、骨膜、脂肪组织、脐血等。来源物种：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、猪等。,分离方法,骨髓,人，猴子，犬,密度梯度离心法：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。,大鼠，小鼠，兔子：全骨髓贴壁法,脂肪等组织：,人、大鼠、小鼠：酶消化法,鉴定方法不同物种的表面标记差异：,表面标志人,猴子大鼠小鼠,阳性CD29,CD44,CD71,CD90CD29,CD44,CD105CD29,CD44，CD166,阴性CD34,CD45,CD105,CD166CD34,CD45弱阳:CD34，CD4

14、5,传代能力,有限增殖，随着传代次数增加，分化能力逐渐降低，按照1：2的比例：,人：12代达到纯化，最多1520代。,大鼠：34代达到纯化，最多2025代。,小鼠：78代达到纯化，最多2530代。,间充质干细胞培养的问题/解决方案,BMSCs：来源长骨的骨髓，体内与造血功能有紧密关系，,但是也存在牙髓和其他短骨里面，缺点是取材时给病人的痛苦较多；,ADSCs：来源全身的脂肪组织，包括皮下和内脏脂肪垫；,来源属于微创方法取材，主要是来源于抽脂减肥的手术；,其他来源的间质干细胞：胰腺干细胞、心脏干细胞、肝脏干细胞、肌腱干细胞和牙周膜干细胞等；还有新生儿的脐带、胎盘等其他组织；,细胞形态：不同的组织

15、来源的间质干细胞的形态多样，,基本无法从细胞的形态上进行有效的区分；,表面抗原：不同来源的细胞的表面标记会有差异BMSC和ADSCs的区别就是CD106（+/-）和CD49d（-,/+）；,分化能力：会有较大的波动，随着不同个体、不同组织,来源会有变化；,培养液选择：不同来源也是不同！,间质干细胞形态特征,P0,40X,P3,40X,骨髓间质干细胞定向分化为脂肪细胞,梭形、纤维样细胞原代：克隆样生长传代后：匀质、涡旋状排列,HumanDog,RatMonkey,MouseRabbit,间质干细胞培养系统,标准：,1.增殖速度变化；2.细胞分化影响；3.形态学变化；,4.克隆形成率变化；5.基因

16、表达影响；,6.使用的特殊要求；7.价格因素；,如何选择间质干细胞培养系统？,基础培养基的选择:依据细胞的生长和要求参照文,章进行优化，需要添加部分的氨基酸或者糖；,血清筛选：应该利用10株以上的细胞，进行克隆,形成率、生长曲线、分化能力的比较；,添加物：营养物质、抗氧化物质、抗生素、细胞,因子添加；,优选专业血清,普通胎牛血清,普通牛血,清,细胞培养过程常见问题,细胞增殖速度下降：间质干细胞不是无限的细胞系，最佳的实验窗口是P3-P8；,细胞老化：培养环境不适合（包括培养的表面和培养液）；胰酶对细胞表面蛋白的伤害；缺乏相关的生长因子；细胞本身端粒影响；,细胞分化：血清中激素影响、培养表面影响

17、、体外培养时间影响；,间质干细胞常见的污染和控制,细胞污染、造血系统细胞；,取材来源污染：病毒、或者其他感染；,支原体污染：隐性污染，一般难以察觉，导致细胞状态不断下降，影响细胞正常增殖，扩散和污染环境，影响最大；,神经干细胞,广泛存在于成年或胚胎哺乳动物大脑内,可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。,神经干细胞,神经干细胞生物学特性,Nestin阳性,自动聚集成球，球体的表面存在绒毛悬浮生长,无血清培养，血清替代物，bFGF，EGF,神经干细胞,NSC存在神经系统中的干细胞,分化：神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞等,NSC取材和培养,鼠神经干细胞（NSC）：来源于14.5d胚胎的大脑

18、GE区；,大鼠神经干细胞-悬浮培养小鼠神经干细胞-贴壁培养,大鼠神经干细胞-贴壁培养小鼠神经干细胞-贴壁培养,使用Cyagen 神经干分化试剂,使用血清诱导,NSC的操作要点：,传代培养：,1、悬浮培养必须控制球的大小，传代时,自然沉降，去除其中大球；可以使用机械的方法；,2、悬浮法培养可以获得大量的细胞；,3、贴壁法培养细胞可以用于转基因操作，,但是费用很高；,4、整个培养过程必须保证无血清；5、保证细胞纯度，获得高扩增率；,干细胞的分化机理和相关的技术产品,干细胞分化机理,Wildtype,mouse,fibroblasts,Mouse,Fibroblasts,Carrying,Myf5

19、BAC,干细胞分化能力鉴定,分化试剂（检测干细胞的尺）：必须稳定，否则结,果波动非常大，将无法分析；,每次配置的分化试剂：必须是有阳性对照进行检测，保证有分化诱导能力再用于检测其他的细胞；不同的物种间最佳的诱导物浓度不同，所以不同物种间最好做一下浓度上面的优化；,干细胞分化的常见问题,分化比例影响因素；,细胞群分化能力：整个细胞群体中干细胞的比率决定；代数：细胞的分化比率随代数增加下降；,诱导系统稳定性：诱导组方、药物效价和配置过程影响；,分化时间影响因素,成骨：2-4周成脂：2-4周,成软骨：3-4周,不同物种：人和大鼠容易诱导，小鼠的需要更长时间，狗和兔子诱导时间波动大；,动物大小影响：人

20、和灵长类、狗等胚胎期或者新生代幼体分化率偏低；而成体的来源的MSC分化能力高！,脐带、脐血的MSC分化比例较低。,细胞质量影响才是影响分化关键的核心！,分化的影响因素,不同的物种：波动很大，不能横向比较；,不同提取方法：操作方法的差异，导致细胞群组成差异；,不同的培养系统：影响细胞的形态、大小、克隆的形态也不同，分化能力也有差异；使用a-,MEM会降低干细胞的成脂肪分化；,不同代数：分化也是会有波动，同时各个方向的分化变化的速度不同步；,Cyagen提供完善的分化系统,骨、脂肪、软骨分化：囊括了多个物种、多种来源的干细胞的分化的试剂；稳定高效：干细胞的金指标；心肌分化、神经分化,Oricell

21、TM提供定制的分化服务；,干细胞大规模培养解决方案,应用的方向；,大动物的体内实验：包括灵长类 等，需要的细胞量都是,108这个数量级以上；,多组动物的实验：要获得更加有说服力结果；大规模的筛选：中药成分筛选、药物单体实验；临床使用干细胞：干细胞的最终应用；,OricellTM 提供大规模细胞培养服务,OricellTM大规模培养的实现,使用T175培养：数量上可以直接增加，但是增加污染的风险，系统不稳定；,使用多层培养瓶、转瓶；,使用小型细胞培养罐：细胞扩增容易但是收获困难，条件控制不成,熟；,密闭的细胞工厂系统：全密闭系统，可以用增加数量方法放大规模，但是成本较高，需要环境控制系统；,干细

22、胞质量控制和解决方案；,表面标记与细胞分化：,表面标记有哪些核心标记：现在目前并未有一个非常特异得到公认的表面抗原分子；,Cyagen研究发现，表面抗原分子和分化不具有,稳定相关性；,表面抗原变化主要集中在前期和高代数时变化；分化能力的变化主要和代数有关，和表面标记有半相关性；,干细胞增殖能力指标；,生长曲线：表现细胞自我更新能力的一个指标；克隆形成率：表示具有较强自我更新能力的细胞,的比例的指标；,属于和干细胞“Self-Renew”相关；,体内实验使用细胞污染物控制,细胞污染物的控制和检测方法；,细胞间污染：不能不同细胞一起操作，使用相同的一瓶试剂；操作最好间隔1个小时；,细菌污染：所有使

23、用的培养试剂进行无菌检测；,真菌污染：严重影响细胞体内试验，一旦出现极难处理；内毒素：对所有使用的器械、容器、管道都进行处理，,250度干烤或者是用碱洗；,外源异物污染：避免使用玻璃操作，使用有认证的产品，个人防护；同时使用前对细胞悬液中进行观察，看是否有颗粒；,大规模和有稳定质量控制的细胞的应用,动物的体内试验和解决方案,干细胞的动物体内实验,干细胞体内应用的注意事项,冻存的细胞是否可以复苏直接用于实验；理论上是可行，但是对冻存液要求很高；复苏率达到90%以上，减低死亡细胞影响；,MSC类的细胞普通冻存液复苏后细胞非常的脆,弱，最好经过一次的培养；,需要清洗：去血清和DMSO（2.5-11g

24、/kg），同时降低内毒素；,Oricell TM NCR冻存液、DMSO-Free冻存液,细胞自然成团对体内实验的影响,导致血管内出现细胞栓塞，直接导致动物急性死亡；,会在肺部、肝积聚，减低器脏功能，长期会有纤维化风险；,细胞在悬浮的状态下，会自然的聚集成松散团；死细胞多，释放的DNA会导致细胞聚成大团；,1.一小时内使用：,2.细胞充分吹匀或者使用滤网：200-250目3.培养过程中细胞绝对不能过密：80%最佳4.细胞代数不能太高P5,体内试验的实现方法：,注射的方法和溶剂；,局部注射：肌肉、肝、中枢神经系统内；全身注射：鼠尾静脉、兔子耳缘静脉等；溶剂：培养液、PBS、HBSS、生理盐水；污

25、染物的控制；（内毒素、热源、真菌污染、外源物质污染的影响）,体内研究：示踪作用,GFP/RFP干细胞研究中重要作用,干细胞移植后在体内的生物学变化（如迁移、分布、增殖、分化等）都离不开对植入干细胞的示踪和定量技术。,GFP或RFP由于检测方便、表达稳定和不影响细,胞功能等特点，目前在干细胞的移植研究中GFP或RFP的重要性越来越得到重视。,GFP、RFP标记,绿色荧光蛋白（GFP）红色荧光蛋白（RFP）,拟人化绿色荧光蛋白（hrGFP）,GFP、RFP标记的优点,检测方便：不需要底物或辅因子,可对活体检测,因而可对被标记对象进行动态、连续的观察。荧光稳定，不易淬灭，尤其是hrGFP对细胞的毒性

26、较小,GFP标记的人胚胎干细胞,GFP/RFP标记的小鼠胚胎干细胞,GFP标记的间质干细胞,成人间质干细胞,胎儿间质干细胞食蟹猴间质干细胞,F344大鼠间质干细胞,SD大鼠间质干细胞,Wistar大鼠间质干细胞,神经干细胞,人神经干细胞,小鼠神经干细胞,GFP标记的小鼠神经干细胞,干细胞应用研究,赛业（广州）生物科技有限公司,干细胞研究为什么引起这么大的重视,肌萎缩侧索硬化病(ALS),Alzheimers Disease,造血干细胞移植,我国白血病的年发病率为4/10万人，每年新增约4万名白血病患者,其中约2万名是儿童。我国长江流域以南的两广和云贵地区的地中海贫血的发病率高达10%以上,广东

27、省每年新增重度,beta-地贫患儿400名。,一些重度自身免疫性疾病,如红斑狼疮,多器官硬化等发病率更高。,造血干细胞移植存在的问题,移植后造血恢复缓慢,移植物抗宿主病(graft-versus-host,disease,GVHD)是骨髓移植(BMT)后出现的,多系统损害(皮肤、食管、胃肠、肝脏等)的全身性疾病，是造成死亡的重要原因之一。,间质干细胞的临床应用,促进造血和免疫功能重建治疗GVHD,心脑血管疾病免疫系统疾病,间质干细胞（MSC）的优点,间质干细胞在骨髓中就是造血干细胞的支持细胞,MSC的低免疫原性,MSC的免疫调节作用，降低免疫应答MSC诱导免疫耐受,MSC表达多种趋化因子受体，

28、体内可趋化迁移,到受损组织和器官,间质干细胞促进造血恢复和免疫重建，降低GVHD,前期动物试验显示:,1.MSC促进受体鼠的外周血白细胞、血小板、淋,巴细胞的明显恢复；,2.帮助胸腺、脾脏的结构重建，加速T细胞恢复3.降低GVHD的发生率及严重程度,MSC治疗慢性GVHD的临床试用MSC治疗难治性cGVHD的临床试用治疗慢性GVHD病人10例，其中7例病人的口腔溃疡、皮疹、肝功能异常、关节酸痛等症状有明显好转。MSCs输注量:,异体MSCs数自体MSCs数脐血输注量：有核细胞CD34+细胞,4106/kg8106/kg6 107/kg5105/kg,MSC输注对移植物抗宿主病的疗效,间质干细胞

29、的其他临床应用,缺血性心脏病，如心肌梗死,缺血性脑病，如脑梗死，缺血缺氧性脑病肝脏疾病，如肝纤维化肾脏疾病，如急性肾衰,组织工程应用,纳米材料：,成骨诱导，表面结合DEX-Vc,与纳米材料结合软骨细胞,组织工程存在的问题,细胞和材料的相容性问题细胞对材料表面的要求材料的生物安全性,细胞来源安全性问题组织生长的调控,细胞在材料内部的功能性恢复,临床使用上面的相容性问题,良好的生物材料的要求,1、生物相容性：组成和结构与人体相应组织相,似，无免疫排异原性，良好生物相容性及组织相容性，能与宿主组织愈合，诱导再生性修复。,2、生物力学顺应性：满足应用场合的生物力学,要求。,3、生物降解性：能按需要降解

30、，做到随再生组,织的生长而作顺应性降解，使组织的生长与材料降解同步。,4、材料表面或者材质能够植入后，在原位诱导,组织再生。,骨组织相容性的检测,神经干细胞的临床应用,脊髓损伤,缺血性脑卒中,神经元退行性病变，如ALS、帕金森病等,胚胎干细胞的临床应用,无限增殖、多向分化潜能,目前还存在较多的问题，主要是在动物实验阶段。目前关于胚胎干细胞治疗相关动物模型的实验研究较多，如帕金森病等。,胚胎干细胞其他应用,建立胚胎干细胞的体外分化模型,建立各种基因改变的胚胎干细胞系,以求发现某些基因或细胞因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的作用。,利用新生（Postnatal,day 0）Nestin-

31、GFP转基因小鼠研究证明多个脏器Nestin表达阳性,Sperm development defect of CDYL homozygotes F,药物筛选的平台,新药在临床使用前需要进行一系列的检测和实验,这些实验都依靠动物来完成。,但是动物模型实验不可能完全反映药物对人体细胞的作用。,胚胎干细胞能模拟体内细胞或组织对被检测药物的反应,从而提供更安全、更有效、更经济的药物筛选模型。,干细胞冻存复苏方案,赛业（广州）生物科技有限公司,干细胞的冻存原理,在不加任何保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变

32、性等，能引起细胞死亡。,如向培养液中加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在130以下的低温中能减少冰晶的形成。,细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-,50，细胞仍能生长，活力受损不大。,干细胞冻存液的选择,选择一种省时高效、安全稳定的冻存液，,是做好细胞冻存的关键！,什么是NCR冻存液？,Non-Control Rate NCR,无控制速率,就是降温过程无需控制,OriCellTM NCR冻存液研发机理,高山植物复活草耐过冰雪严寒仍能复活，某些昆虫在高寒条件下可以不冻死；都是因为其自身含有一些保护物质，能在极端环境下保护细胞不受损伤。,

33、OriCellTM NCR冻存液的研发机理,Cyagen团队模拟自然界这种神奇的自我保护能,力，在冻存液里添加了多种抗寒膜外保护剂、渗透性保护剂及沉降稳定剂，使细胞在低温环境下得到很好的保护。,OriCellTM NCR冻存液的作用机理,细胞膜保护剂-可在细胞膜外瞬间形成一层保护膜，保护细胞不受细胞外冰晶的损害。,渗透性保护剂-可迅速渗透至细胞内部，防止细胞内部产生大量冰晶，同时可保护细胞器，减少其在低温下的损伤。,细胞沉降稳定剂-可平衡细胞沉降速度，防止细胞在冻存过程中聚集成团。,Oricell,TM,NCR-Cryopreservation medium,Oricell TM NCR-Cr

34、yopreservation10%DMSO inFBSControlNomal Cryo,细胞复苏率%,OricellTM NCR-Cryopreservation mediumNCR-Cryopreservation Medium10095908580757065605550,C57BL/6,Balb/C,Wistar SD Rat,F344,Rabbit,Canine,Monkey C57BL/6,129,ICR MEF,MouseMSC,MouseMSC,Rat MSC,MSC,Rat MSC,MSC,MSC,MSC,MouseEsc,MouseEsc,细胞种类,传统细胞冻存液,大部分实

35、验室会自制冻存液来冻存干细胞；,其缺点在于：,是需花大量资金购买程序冻存仪器，或花上半天的时间去等待细胞的程序降温。,自制冻存液质量不稳定，批次间差异较大，容易造成细胞复苏率低和实验的不可对比性。,新手未掌握冻存时间，在环境转移过程中容易造成温度波动而损害细胞。,Cyagen的无程序冻存液,无需程序降温，-80一步冻存、无血清、无任何蛋白；高复苏率90%,不影响干细胞的特性；细胞增殖不改变、细胞,分化不改变；,容易使用、稳定性高,可以直接使用，无需任何的操作,冻存过程中细胞环境稳定，无温度波动,干细胞的冻存,冻存流程：,1、选择处于对数生长期的细胞，按照常用的方法收集细胞于试管中，计算细胞数量

36、。,2、离心收集的细胞（参考离心条件：4，250g，3-5分钟），吸去上清液。,3、加入适当的冻存液到离心管，缓慢混合均匀，制成细,胞混合液。细胞冻存浓度约为105106Cells/ml。,4、将离心管中的细胞混合液分装至已做标识的冻存管。5、将分装好细胞的冻存管直接放于-80冰箱，24h后可以移入-196液氮中长期保存。,干细胞的复苏,复苏流程：,1、准备好相应的细胞培养液，平衡至室温；往离心管中加入6-8mL细胞培养液。准备37水浴。,2、从-80冰箱或液氮取出冻存的细胞，迅速放入37水浴中快速晃动，待冻存悬液完全溶解后，往冻存管中加入1mL细胞培养液，稍微吹打后立即将细胞混合液移入装有细胞培养液的离心管中，混合均匀。,3、离心收集的细胞（离心条件可参考细胞冻存方法），尽量移去上清液。,4、加入细胞培养液重悬细胞，制成细胞悬液，按各自实验所需密度接种至细胞培养器具中。,我们的合作伙伴：,非常感谢大家对我们的关注！,