分子遗传学3纸板.ppt

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1、第三章 DNA的复制,复制（replication）：是指以原来的DNA分子作为模板合成出相同分子的过程。复制在保持生物稳定性方面起重要作用；复制是细胞分裂的前提和基础；复制是精确的复制，一般不会差错；复制方式为半保留复制（semiconservative replication）。,第一节半保留复制的验证,半保留复制：亲代DNA的两条链解开，每条链都作为模板形成两个子代DNA分子；新合成的每个子代DNA分子中，一条链来自亲代DNA分子，另一条链是新合成的。半保留模型（semioconservetive model）全保留复制模型(conservetive model)分散模型(Dispers

2、ive model),验证半保留复制的实验,Meselson-Stahl实验Taylar实验姐妹染色单体差别染色方法Cairns复制模型型复制,第二节 复制的起点、方向和终点,一.研究方法：1.用同位素标记电镜观察：1973年R.L.Rodrigue等提出的，验证了E.coli环状DNA是双向复制，一个复制起点，且终点在起点对面。2.用噬菌体插入标记法 同步培养 不同步培养 3.变性定性法4.双向电泳法,二、原核的复制起点和方向,复制起点（origin,ori）：DNA分子上特定的发动复制 的起始位点。复制终点（terminus）：DNA分子上复制终止的位点。复制子（replicon）：从复制

3、起点到复制终点这样一个 完整的DNA单位称为复制子。原核细胞基因组实质为一条双链DNA分子，作为一个复制子，整个基因组的复制起始于单一位点（起点）；真核细胞基因组庞大，有多个复制起点和复制终点，含有多个复制子。,复制的特点：,E.coli定点、双向对称复制;T7（噬菌体）在近一端的17处开始，向两端延伸;枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制;一侧复制基因组的4/5，另一侧只复制1/5，终点也不在Ori的对面。质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组时进行双向复制;质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制;mt（线粒体）DNA进行D（displaced loop）环复制。,8,D-环

4、复制时需合成引物。mtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。,dNTP,DNA-pol,复制过程在研究真核细胞内线粒体DNA的复制时，发现了DNA的D环复制。复制过程四阶段。D环复制的特点是两条链的复制不是同步的。1.H链首先合成：在复制起点处以H链为模板，合成RNA引物，然后由DNA聚合酶催化合成一个500-600bp长的H链片段。该片段与H链以氢键结合，将亲代的L链置换出来，产生D环复制中间物。新的H链DNA片段由于分子3端终止的位置不定而长短不一;也有一

5、些3端位置是固定的，而由于5端被降解而使整个DNA片段长短不一。合成这样500-600bp长的DNA片段不会引起线粒体DNA超螺旋结构的明显改变。2.H链片段的继续合成：上述产生的H链片段由于太短而很容易被挤出去恢复线粒体DNA完整的双螺旋结构。但有时这个片段会继续合成，这需要依靠拓扑异构酶和螺旋酶的作用将双链打开。3.L链合成开始：以被置换下来的亲代L链为模板，离H链合成起点60%基因组的位置开始合成L链DNA，合成也需要RNA引物。4.复制的完成：H链的合成提前完成，L链的合成随后结束。线粒体DNA合成速度相当缓慢，约每秒10个核苷酸，整个复制过程需要1个小时。刚刚合成的线粒体DNA是松弛

6、型的，需要40分钟将其变成超螺旋型,考察基因功能的常用方法-突变体的表型变化突变型可分为二类：一类为可以补偿的；另一类为不可补偿的；考察复制有关酶的常用突变型-温度敏感突变体 此突变体属于条件致死突变型，即：在25正常生长，42不能生长致死。,第三节 原核生物复制的酶系统,利用大肠杆菌温度敏感突变体研究与复制有关基因(dna)一般复制的过程包括：起始、延伸和终止3个阶段。每一阶段的蛋白质和酶不完全相同，可利用如下2种突变体来筛选。快停突变体：温度升高(42-45)，复制立即停止。缺失复制体组分的 酶，特别是延伸的酶或参与供应关键前体的酶。dna突变体 慢停突变体：在非允许温度下(42-45)，

7、可以完成当前的复制，但不 能开始新的复制。缺失复制起始有关的酶。,一、DNA聚合酶(DNA polymerase)全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,DNA聚合酶的共同特点：需要提供合成模板；不能起始新的DNA链；必须要有引物（一小段DNA或RNA）提供3-OH，在此基础上聚合添加；合成的方向都是53（即子链是53）；除聚合DNA外还有其它功能（如校对、修复等）。,E.coli 中主要的三种DNA多聚酶,（一）DNA聚合酶I,发现：西班牙裔美国人A.Kornberg等在1956年完成第一例体外合成DNA实验。从大肠杆菌

8、中分离得到一种酶，此酶可以将核苷酸共价连接在一条已经存在的DNA链上，称此酶为DNA聚合酶I或Kornberg酶。,15,单一肽链的大分子蛋白质，分子量约为109KD，每个细胞中大约存在400个,DNA-pol(109kD),DNA聚合酶I的结构（要求）,由PolA基因编码的单个肽链，MW：103KD可被枯草杆菌蛋白切成2个片段：小片段位于N端35KD 大片段位于C端68KD即Klenow片段DNA聚合酶I有6个结合位点；模板结合位点；(有引物的ssDNA,有缺口的dsDNA)引物结合位点；(引物可以是一小段DNA或是RNA)引物3OH结合位点；底物dNTP结合位点；53外切酶结合位点；（位于

9、N端小片段）35校正位点。（靠C端大片段偏中间部位）,17,323个氨基酸,小片段,5-3核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 3-5核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,DNA聚合酶的功能（要求）对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,1.53聚合功能；主要用于DNA的修复和后随链中RNA引物的置换。2.35外切活性；主要起校正功能，切除合成中错配的碱基。3.53外切活性；(1)切口平移（nick translation）；(2)链的置换；(3)模板转换（template-switching）；4.内切酶活性：主要用于切除

10、修复系统，正常复制中无。,19,（二）DNA-pol（120kD）,DNA-pol 基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,（三）DNA多聚酶,发现：针对一株dnaE基因缺失突变型的研究，其在25可以正常生长合成DNA，当转移至43时，DNA的复制过程终止，这表明dnaE的表达产物是DNA合成所必需的。证实dnaE基因的编码产物是DNA聚合酶III的亚基，其具有53聚合酶活性。,21,DNA pol（830kD）,功能：,是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,22,由

11、十种亚基构成的不对称异二聚体。,53 聚合酶活性,3-5外切酶活性和碱基选择功能,维系二聚体的作用,DNA多聚酶结构组成如下图：,全酶在DNA上的装配分为三个阶段,一个二聚体加上一个复合体识别引物模板形成一种前起始复合物；DNA在与、复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和力使核心酶能与DNA结合；二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。,DNA多聚酶的功能,53聚合酶功能：能催化DNA沿53 方向延长对模板要求高，仅有缺口100nt的dsDNA才可做模板。35外切酶活性：与DNA聚合酶I相同，有校对功能。53外切酶活性：与DNA聚合酶I不同，仅能以单链为底物，不能进行缺口平移。DNA多

12、聚酶是合成DNA的主角，一般合成长片段如前导链和后随链冈崎片段的合成。,26,原核生物的DNA聚合酶,27,常见的真核细胞DNA聚合酶,二、DNA连接酶（DNA ligase）,*作用是连接DNA分子，将相邻的3-OH和5-P连接成磷酸二酯键，封闭缺口。其作用过程分三步进行：1.EATPEAMPppi 在E.coli中：ENADEAMPNMN2.E-AMP上的AMP转移到DNA的5-PO4上使其活化；3.活化的5-PO4与相邻的3-OH作用形成35 磷酸二酯键，并释放出AMP。*此酶在后随链的合成、DNA的损伤修复、重组及转座中发挥重要的作用。,29,需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DN

13、A片段具有5-Pi；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。未封闭的切口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；,DNA连接酶的催化特点：,30,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的作用：,三、螺旋酶（helicase）,又称解旋酶，是解开氢键促进DNA的两条互补链分离的酶。是DNA复制、重组、修复过程中关键的发动蛋白；具有依赖DNA的ATPase活性，利用ATP水解产生的能量解旋DNA并使螺旋酶沿DNA链移动。一般每解开一对碱基需要水解一个ATP。与产物单链DNA结合，

14、如螺旋酶，螺旋酶。螺旋酶 仅仅催化DNA双链的分离，常与SSB蛋白结合 如E.coli 中rep蛋白，螺旋酶。,四、单链结合蛋白SSB（single binding protein）,单链结合蛋白：又称双螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing protein)，可以结合单链，防止形成双链或发夹结构，同时保护单链不被核酸酶水解。在E.coli 中，SSB是由177个aa组成的蛋白质;以四聚体存在;分子量为74KDa;结合单链DNA可覆盖32nt，保护DNA。在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应（第一个SSB的结合能力是1，则第二个SSB的结合能力为1000）：（1）SSB之间

15、的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。真核生物的复制系统中具有复制因子A（RF-A）相当于SSB，但无协同作用。,34,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,DNA复制的拓扑性质,五、拓扑异构酶,35,DNA复制时，两条链打开，必然造成DNA分子形成缠绕、打结、连环等现象，从而产生扭曲张力。闭环状的DNA按一定方向扭转形成超螺旋。盘绕过分称为正超螺旋，盘绕不足为负超螺旋。复制时，部分DNA要呈松弛状态。,36,拓扑异构酶的作用特点:既能水解、又能连接磷酸二酯键,*拓扑异构酶*拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶（topoiso

16、merase）,拓扑异构酶：催化DNA环的拓扑异构体之间转化的酶，它可以在切割DNA的单链或双链后，催化一个 DNA分子单链或双螺旋链穿过断裂的单（双）链再重新闭合。,37,DNA拓扑异构酶的作用机制,38,小结：参与DNA复制的酶和蛋白质,主要成员,功 能,DnaA 识别复制起始位点,解螺旋酶 解开DNA双链,SSB 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,拓扑异构酶 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA-pol DNA复制延长中起主要作用,DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,第四节 原核生物和病毒的复制,原核细胞染色

17、体DNA的复制起始于固定位点，双向复制；噬菌体、病毒核酸的复制可以起始于不同位点，双向或单向复制，也可以采取特殊的复制方式，如滚环复制。大肠杆菌-环状DNA分子F质粒(F因子)-环状DNA分子噬菌体-有环状DNA分子也有线状DNA腺病毒-线状DNA分子,40,DNA复制时，在DNA合成的复制叉上，分布有各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制体。,Dna A,Dna B Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,复制体结构的变化形成复制的不同阶段。大肠杆菌DNA的复制分为三个阶段：起始、延伸和终止。,一、大肠杆菌环状DNA复制的过程,41,需要解决两个问题

18、：,1.DNA解开成单链，提供模板,2.合成引物，提供3-OH末端,（一）起始阶段,42,1解旋解链，形成复制叉,复制起始位点oriC的结构特点:E.coli的复制起点跨度为245bp包括3组13bp串联重复序列和2对9bp反向重复序列作为蛋白结合位点；富含AT，这可能和双链易于解开起始复制有关；,44,DnaA蛋白识别并结合到复制起始位点（ori）的9bp重复序列。2040个DnaA蛋白各带一个ATP相互靠近与DNA形成类似核小体的结构。,解旋解链：,45,形成的复合物促使邻近的3个串联重复序列解链。解螺旋酶（helicase,DnaB）六聚体在DnaC蛋白协同下，结合到开链的中间复合物上，

19、解开双链，形成两条单链DNA，并逐步置换出DnaA蛋白。单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，使复制叉保持适当长度。,47,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体(primosome)。,2引发体组装和引物合成：,Dna A,Dna B Dna C,引物酶,SSB,3,5,3,5,48,引物酶催化合成短链RNA引物分子 在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,3 OH,5,3,5,3,5,引物,引物酶,DNA拓扑异构酶,Dna B Dna C,SSB,解

20、链是一个高速的反向旋转，其下游势必发生打结现象，因而需要DNA拓扑异构酶参与。,50,复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶。,（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制,*半不连续复制：在DNA的双向复制中，其中先导链是沿着复制叉进行延伸，为连续复制，后滞链是逆复制叉方向进行不连续复制，每次合成的DNA为一个岗崎片段（约1000-2000nt），DNA的这种复制方式称为半不连续复制。DNA的复制方向为5

21、-3；岗崎片段的大小约为1000nt，每个岗崎片段的合成都包括新一轮的起始发动的过程；岗崎片段间的缺口由DNA聚合酶催化填充；DNA连接酶连接间断点DNA，形成完整的DNA链。,后随链的合成过程,不连续复制模型：1968年日本的冈崎等提出，做了2个实验（脉冲标记实验和脉冲追踪实验）验证，复制出的DNA片段长约1000-2000nt。半不连续复制模型：1978年B.M.Olivera提出，前导链的合成是连续的，后随链的合成是不连续的。片段的形成是因为DNA中U的混入，被尿嘧啶N-糖苷酶切断所致。复制体和回环模型：复制体：由解旋酶、引发酶和DNA聚合酶III全酶组成的复合体，在DNA合成中沿着复制

22、叉的方向推进。回环模型：复制体中，后随链模板形成一个回环，使环中RNA引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制。,后随链的合成过程,53,催化领头链和随从链是在同一DNA聚合酶的催化下延长的,Pol为不对称二聚体，一个作用于前导链，另一个作用于随从链(loop)。在DNA聚合酶的作用下，领头链合成1000-2000个核苷酸后，随从链开始合成，岗崎片段的长度 为1000-2000个（大肠杆菌）,54,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,ori,ter,E.coli,72,32,1.去除RNA引物,填补缺口2.把DNA连接成完

23、整的子链,终止的任务包括:,（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口,E.coli的复制终止现已发现有两对终止区域（terE,D,A和ter C,B）位于相遇点的两侧约100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的；ter顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性；终止需要tus(terminus utilization substance)基因的产物Tus(36kD)，Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进；ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来封闭复制叉的通路实行终止。,56,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来

24、水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。,1.去除引物，填补缺口：,57,在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,2.连接冈崎片段：,58,复制起始：解链过程：DnaA、DnaB（解螺旋酶）、DnaC 引物酶加入，形成引发体，合成引物。拓扑酶、SSB的参与。2.复制延长：DNA-pol起主要作用；子链延长方向53；领头链连续复制，随从链形成冈崎片段。3.复制终止：RNA酶水解引物；空缺由DNA-pol催化合成DNA填补；DNA连接酶连成完整的子链等。,原核生物复制小

25、结：,二、滚环复制（rolling circle replication）,滚环复制：是小分子量的环状DNA分子所采取一种特殊复制形式。在滚环复制中，先导链借助模板环的滚动复制产生环状分子拷贝。1968年Gilbert 提出滚环复制模型:（1）一条链断裂，产生 自由3OH 末端；（2）只有一个复制叉;（3）不需RNA引物，在正链3OH上延伸；（4）可形成多联体（concatemer）;（5）模板链和新合成的链分开;,进行滚环复制的DNA分子类型：,真核rDNA的扩增；细菌F因子DNA的转移；噬菌体裂解途经的复制；X174、M13、G4等病毒的复制；如：X174为单链环状DNA噬菌体，为单正+链

26、，其复制第一步是合成一条互补的负-链产生双链环；第二阶段复制进行滚环复制。,三、线状DNA复制起始及末端补齐,线性双链DNA的复制有的是从一端开始的，称为末端起始复制。如腺病毒（Adenovirus）、29 DNAs、脊髓灰质病毒（poliovirus)。腺病毒DNA全长35937 bp,线性双链；两端各有反向重复顺序103162bp，两末端各有50bp为复制起点；其复制是以单链置换（strand displacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。线性双链DNA复制的末端补齐：腺病毒利用末端蛋白代替RNA引物；真核生物染色体的末端依赖端粒酶的特殊功能；,第五节 真核细胞DNA的

27、复制,真核细胞中染色体DNA的复制是通过许多独立的复制子（复制元）来完成的，每个复制子都有固定的复制起点，采用双向复制；染色体DNA为线性分子，各复制子不一定同时活化，但在细胞的一个分裂周期内只能复制一次；复制的调控机制尚不清楚；对真核细胞DNA的复制研究常以感染宿主细胞的病毒（SV40）复制为基础，因为两者的复制有相似之处。,65,（一）真核生物复制的起始与原核基本相似,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动。复制起始点比原核生物短，富含AT，称为自主复制序列（ARS，autonomous replication sequence）

28、。,66,多起点、双方向,真核生物：从起点开始，以双向等速进行，一个DNA分子上有许多个特定的复制起点。,67,真核生物所含的DNA聚合酶种类更多：真核生物DNA pol 已发现有5种，分别命名为：,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制,应急修复。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,68,增殖细胞核抗原(PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，

29、即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,69,（二）真核生物复制的延长发生 DNA聚合酶/转换,DNA-pol 引物酶活性，催化合成引物；DNA-pol 解螺旋酶活性，催化合成子链 引物合成后，DNA-pol 在PCNA的协同下将DNA-pol置换出，然后催化合成子链。冈崎片段长度约为n135bp(一个核小体所含DNA的量)随从链合成过程中DNA-pol与DNA-pol 之间的转换频率大。,70,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,真核生物复

30、制叉的延长：,领头链的连续复制也只限于半个复制子的长度,71,（三）复制的终止端粒酶参与解决染色体末端复制问题,1.去除引物RNA酶、DNA酶,2.把DNA连接成完整的子链,复制终止阶段需：,72,复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接(与原核生物类似)染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。(与原核生物不同),73,真核生物染色体DNA是线形结构。线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解可能出现缩短。,74,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,真核生物通过端粒的特殊复制方式来解决复制中DNA逐渐变短的问题,7

31、5,功 能:,维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性,端粒的结构特点:,由末端线性DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。,76,一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录的方式对末端DNA链进行延长。,端粒酶(telomerase),77,端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),人类端粒酶的组成,78,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,端粒合成完成,