特殊毒性作用及其试验与评价方法.ppt
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1、特殊毒性及其试验,特殊毒性试验:致突变试验 致畸试验 致癌试验 繁殖试验(生殖试验)行为试验,一、致突变试验,(一)细菌回复突变试验(Ames test)(1)原理 试验菌种 野生型 突变型 鼠伤寒沙门氏菌 his+his-在缺乏his的培养基 能生长 不能生长,主要是检查受试物引起遗传物质结构的改变及其引起的性状变异的试验,his-AA缺乏,Ames试验原理:,野生型His+,突变型 His-,正向突变,回复突变,物理化学等因素处理,受 试 物,His-培养基,接种,能生长,有致突变性,不能生长,无致突变性,+,(2)使用菌株Ames 1975年推荐的沙门氏菌标准菌株为:TA98,TA100
2、,TA1535,TA1537,TA1538;1983年改推荐用:TA97,检测移码;TA98,检测碱基置换;TA100,检测碱基置换及移码;TA102,检测碱基置换及移码。,(3)试验方法 致突变试验分体内体外两种情况:体外试验:检测间接致突变物,需加S9(体外代谢活化系统),此法称微粒体间介法。体内试验:可检测直接及间接致突变物,不必加S9 此法称宿主间介法。,(4)关于突变类型 分为:基因突变和染色体畸变 1.基因突变(gene mutation)或称 点突变(point mutation):是指不能用光学显微镜直接观察到的遗传物质损伤 基因突变是遗传物质在分子水平上的改变。包括:碱基置换
3、(base substitution)移码(frame shift)大段损伤(Large deletion or insertion),碱基置换:某一碱基脱落或配对性能改变 DNA复制时碱基错配(mispairing)第二次DNA复制时按正常配对 遗传下去*转换(transition):A G C T*颠换(transversion):A T G C 无论转换或是颠换都只涉及一对碱基,故称点突变。*后果:三联密码子的改变,可能出现同义密码,错义密码或终止密码,从而使基因表达 改变。,移码 是DNA中增加或减少一对或几对不等于3的倍数 的碱基改变所造成的突变。这种突变可造成整个DNA或一个基因阅
4、读框架的 改变。后果:移码易造成致死性突变;,大段损伤 是指DNA链的大段缺失或插入。可能涉及数以千计的Nt(核苷酸)。*小缺失(small deletion):缺失的Nt 远远小于显微镜的观察能力。*插入(insertion):一段游离Nt整合到另一染色体的某一位置。*转座子(trasposon):在质粒(plasimd)与质粒之间和质粒与染色 体之间可能出现转移位置的小段DNA。这种位置的转动称为转座(transposition)*后果:a.gene突变;b.产生新的gene c.染色体畸变;d.生物进化。,2.染色体畸变 结构畸变*裂隙和断裂(gap and break):仍保持线状连接
5、者为裂隙,无线状连接者为断裂*无着丝粒断片和缺失(acentric fragment and deletion)微核(micronucleus):无着丝粒断片。微小体(minute body):小于染色体宽度的无着丝粒断 片,常成双出现。*环状染色体(ring chromosome)*倒位(inversion):断片倒转180再重接。,*插入和重复(insertion and duplication)*易位(translocation)*染色体交换(chromatid exchange):指两条或多条染色单体断裂后变位重接。分为:内换(intrachange):同一染色体内的染色单体交换 互换
6、(interchange):不同染色体间的染色单体交换*姐妹染色单体交换(sister chromatid exchange,SCE):用5-Brdurd掺入DNA合成代替了T,产生染色单体差示染 色,可见到两条姐妹染色单体染色一深一浅,如某一染色体 在姐妹染色单体间发生了同源节段内换,同源节段染色一深 一浅,这种现象称SCE。用以分析染色体畸变。(图示),各有一互补链不带Brdude的原链第二周期插入Brdu产生同等干扰带Brdu的新链合成出现差示染色,断裂、重排同位节段互换,染色体数目异常 整倍性畸变:单、三、四、多倍体 数目畸变 非整倍性畸变:2倍体多一条或少一条 或多多条或少多条 2n
7、-1,2n-2,2n+1,2n+2,染色体数目畸变的原因:a.不分离;b.染色体丢失;c.染色体桥;d.核内复制。,(二)精子畸形试验*常用小白鼠染毒,观察其精子畸形。*精子畸形表现:无钩,香蕉形,无定形,胖头,双头,双尾,尾折叠等。*常与亚慢性毒性试验结合进行。,(三)染色体畸变分析*常用骨髓细胞观察。*观察的内容有:染色体数目畸变:正常:小鼠2n=40,大鼠2n=42 犬2n=78,猫2n=38,豚鼠2n=64 兔2n=44,鸡2n=78,灵长类2n=42 人2n=46。染色体结构畸变:裂隙,断裂,微小体,环状,粉碎,多射体*剂量设计及分组:最高剂量组:LD50的1/8-1/10;中间剂量
8、组:最高剂量组的1/15;最低剂量组:最高剂量组的1/20。,(四)微核试验*微核:细胞核之外,与核染色性一致的颗粒,大小相当于细胞直径的1/20-1/5,形似 杏仁状或圆形。*来源:染色体断裂而形成的无着丝粒断片。*意义:说明染色体的完整性发生了改变,或染 色体分离改变,表明受试物对遗传物质 产生了损伤。(五)分子生物学方法(PCR检测),突变的不良后果,二、致畸试验,(一)概念 主要是检查受试物对动物子代的致畸作用。致畸作用包括:1.母体效应:受试物对母体产生了损害作用,从而影响了正常妊娠,而不是对胚胎的直接损害。2.胚胎效应:受试物对胚胎的直接损害作用。3.出生前胎儿效应:出生胎儿出现外
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