核酸类药物的分析.ppt

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1、第九章 核酸类药物的分析,基本要求,掌握：核酸的结构和分类；嘌呤类药物和嘧啶类药物鉴别、检查、含量测定的原理熟悉：核酸的理化性质；反义寡核苷酸药物鉴别、检查、含量测定的原理,第一节 概述,结构和分类理化性质,什么是核酸？,1869年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的细胞核，当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何一种有机物，并且含有很强的酸性，故得名核酸。1909年其组成被研究清楚，1944年生物功能初步澄清，在X射线衍射技术支持下1953年结构澄清。核酸是脱氧核糖核酸（DNA）与核糖核酸（RNA）的通称。,核酸,核苷酸,水解,一、结构和分类,核 酸,代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA

2、而言为核糖；,代表碱基,代表磷酸基,核苷酸,核苷酸,磷酸,碱基,戊糖,H2O,H2O,碱基,磷酸,戊糖,糖苷键,酯键,核苷酸,碱基连接（糖苷键）,酯键,（对DNA为H）,1,2,3,4,5,戊糖,核糖(in RNA),2脱氧核糖(in DNA),核苷,DNA&RNA,碱基,RNA,DNA,嘧啶环,嘌呤环,尿嘧啶 U,胸腺嘧啶 T,胞嘧啶 C,鸟嘌呤 G,腺嘌呤 A,稀有碱基,嘌呤次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、N2、N2-二甲基鸟嘌呤。嘧啶5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶都是基本碱基的化学修饰型。,鸟嘌呤,次黄嘌呤,1-甲基次黄嘌呤,二、理化性质,（一）两性性质：磷酸基；

3、碱基（通常：酸性）pH影响碱基间氢键稳定：DNA pH4.011.0（二）水解性：微溶于水，不溶于一般的有机溶剂（三）UV：max=260nm 蛋白质280nm A260/A280 纯DNA1.8 纯RNA应达到2.0 混有杂蛋白 比值降低,（四）变性和复性1.变性：在某些理化因素影响下，DNA双螺旋区的氢键断裂和碱基堆积力破坏，有规律的双螺旋结构变成单链无规律的“线团”，但不发生共价键的断裂，这过程称之。变性原因：高温（一般75）、强氧化剂、强酸、碱、尿素等；机理：双链间氢键断开，成为两条单链（DNA双螺旋二级结构的破坏，生物活性的丧失）特征性Tm-DNA的变性温度 8295,2.复性一定条

4、件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活性的现象；通常使用热复性。（退火）,热复性在基因测序中被广泛应用,（五）颜色反应苔黑酚反应:RNA中核糖+浓HCl（浓H2SO4）糠醛+苔黑酚深绿色化合物（max=670nm）二苯胺反应:DNA中脱氧核糖+浓H2SO4 5-羟基-4-羰基戊醛+二苯胺蓝色化合物（max=595nm）水解后磷酸：磷酸+钼酸磷钼酸+还原剂（维生素C、氯化亚锡等）钼蓝（max=660nm）,Fe3+,脱水,第二节 嘌呤类核苷酸药物分析,嘌呤碱（腺嘌呤、鸟嘌呤）戊糖磷酸,一、鉴别,戊糖鉴别嘌呤鉴别磷酸鉴别特征吸收光谱熔点测定,（一）戊糖的鉴别,苔黑酚反应（地衣酚反应）-凡核

5、糖均有此反应试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁（催化剂）现象：鲜绿色二苯胺反应 DNA试剂：浓硫酸，二苯胺现象：蓝色与间苯三酚反应（核苷酸中的戊糖）现象：玫瑰红色,（二）嘌呤的鉴别,+氨制硝酸银白色红棕色（遇光）（嘌呤碱基的特殊鉴别反应）,（三）磷酸的鉴别,有机磷无机磷+钼酸磷钼酸+还原剂钼蓝,（四）特征吸收光谱,UV：嘌呤环，嘧啶环IR,（五）熔点测定,二、检查,一般检查酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色和澄清度蛋白质检查磺基水杨酸溶液有关物质纸色谱，薄层色谱，电泳，荧光检查,三、含量测定,紫外-可见分光光度法现在国家已经批准的嘌呤类核苷酸药物一般都用此法测定含量HPLC,四、实例分析,

6、肌苷ATP,（一）肌苷的质量分析,1.结构：C10H12N4O5 268.23本品为9-D-核糖次黄嘌呤。按干燥品计算，含C10H12N4O5应为98.0102.0。2.性状：本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐酸和氢氧化钠溶液中易溶。,3.鉴别取0.01供试品溶液适量,加等体积的3,5-二羟基甲苯溶液(取3，5-二羟基甲苯与三氯化铁各0.1g，加盐酸使成100ml)，混匀，在水浴中加热约10分钟，即显绿色。-苔黑酚反应取本品1水溶液，加氨制硝酸银试液数滴，即产生白色胶状沉淀。-嘌呤碱基 取含量测定项下的溶液,照分光光度法测定，在248nm的波长处有最

7、大吸收，在222nm的波长处有最小吸收。色谱图IR,4.检查溶液的澄清度与颜色（溶液的透光率）取本品0.5g，加水50ml使溶解，照分光光度法在430nm的波长处测定透光率，不得低于98.0(供注射用)。干燥失重取本品，在105干燥至恒重，减失重量不得过1.0炽灼残渣不得过0.1(供注射用),或不得过0.2(供口服用重金属取本品1.0g，依法检查含重金属不得过百万分之十。次黄嘌呤精密称取本品0.5g，置50ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照纸色谱法试验，吸取上述溶10l，点于325cm色谱滤纸上，照上行法，以水为展开剂，展开约20cm处，取出晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，不得出

8、现杂质斑点。HPLC,5.含量测定1）UV法：取本品，精密称定，加水制成每1ml中约含10g的溶液，照分光光度法在248nm的波长处测定吸收度，按C10H12N4O5的吸收系数（E11cm）为460计算。2）HPLC,6.作用与用途辅酶类药。有改善机体代谢作用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、视神经萎缩等。7.用法与用量口服，一次0.20.6g一日0.61.8g8.贮藏遮光，密闭保存。9.制剂(1)肌苷口服溶液(2)肌苷片(3)肌苷注射液(4)肌苷胶囊(5)肌苷颗粒剂,（二）三磷酸腺苷二钠（ATP）的质量分析,拼音名：Sanlinsuanxiangan

9、erna 英文名：Adenosine Disodium Triphosphate C10H14N5Na2O13P3 551.151.结构：本品为腺嘌呤核苷-5-三磷酸酯二钠盐三水化合物。按干燥品计算，含C10H14N5Na2O13P3不得少于90.0。,2.性状：本品为白色或类白色粉末或结晶块状物；无臭，味咸；有引湿性。本品在水中易溶，在乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶。,3.鉴别（1）取本品20mg,加稀硝酸2ml溶解后，加钼酸铵试液1ml，加热，放冷，即析出黄色沉淀。-磷酸盐（2）取本品约10mg，加盐酸溶液(12)5ml溶解后，加间苯三酚10mg，混匀，置水浴中加热约1分钟，即显玫瑰红色。-戊

10、糖（3）苔黑酚反应戊糖（3）UV（4）IR（5）本品的水溶液显钠盐的鉴别反应,4.检查酸度溶液的澄清度与颜色蛋白质取本品20mg，加水2ml溶解后，滴加30磺基水杨酸溶液0.5ml，不得发生浑浊。有关物质水分氯化物铁盐重金属热原,5.含量测定（1）总核苷酸：UV（2）三磷酸腺苷二钠的重量比：HPLC（3）色谱条件与系统适用性试验（4）测定法,6.作用与用途辅酶类药。用于进行性肌萎缩、脑溢血后遗症、心功能不全、心肌疾患及肝炎等。7.注意缓慢注射。心肌硬塞和脑溢血在发病期患者慎用。8.贮藏有阴凉干燥处密封保存。有效期年。9.制剂(1)三磷酸腺苷二钠注射液(2)注射用三磷酸腺苷二钠,第三节 嘧啶类核

11、苷酸药物的分析,一、鉴别,该类药物的化学组成和性质本与嘌呤类相似，唯一区别在于碱基的不同。一元碱,二、检查,常规检查其他核苷酸：TLC,三、含量测定,UV法电位滴定法,四、实例分析-氟尿嘧啶,1.通用名:氟尿嘧啶 化学名:5-氟-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮分子式:C4H3FN2O2 分子量:130.08 熔 点:278-286 水溶性:12.2g/L 20含氟尿嘧啶（C4H3FN202）应为标示量的93.0-107.0%,2.性状：,白色或类白色结晶或结晶性粉末。在水中略溶，乙醇中微溶，三氯甲烷中几乎不溶，在稀盐酸或氢氧化钠溶液中溶解。,3.鉴别（1）+溴，溴褪色；+氢氧化钡，紫色（2）三

12、氧化铬的饱和硫酸溶液，均匀涂于管壁 本品，不能再均匀涂于管壁（3）max=265nm min=232nm（4）IR,4.检查：氯化物硫酸盐含氟量干燥失重重金属,5.含量测定：取本品适量，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1mL中约含10g的溶液，照紫外-可见分光光度法，在265nm波长处，测定吸光度，按C4H3FN2O2的吸收系数（E1%1cm）为552计算，即得。,用途：本品为嘧啶类的氟化物，属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核，干扰DNA合成。对RNA的合成也有一定的抑制作用。,不良反应：骨髓抑制：主要为白细胞减少、血小板下降。食欲不振、恶心

13、、呕吐、口腔炎、胃炎、腹痛及腹泻等胃肠道反应。注射局部有疼痛、静脉炎或动脉内膜炎。其他：常有脱发、红斑性皮炎、皮肤色素沉着手足综合征及暂时性小脑运动失调，偶有影响心脏功能,注意事项：用药期间应严格检查血象。避光置阴暗处保存，温度不应低于10，亦不宜超过35。治疗期涂药范围有炎症，停药后炎症消退。本品可引起严重的皮肤刺激，尤其在日光下。该药还可经皮损内注射给药用于角化棘皮病、疣和汗孔角化病。其主要副作用为注射期间有的烧感，继之有局部红斑、水肿甚至溃疡。,第四节 反义寡核苷酸药物分析,1.定义2.化学修饰：硫代修饰3.序列分析：化学测序法；质谱法4.杂交性质5.理化特性分析（鉴别：HPLC，CE）（特殊杂质：失败序列；硫代不充分）6.生物活性测定,