核酸的生物化学.ppt

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1、核酸的生物化学,李金明 卫生部临床检验中心,核酸(Nucleic acid)?,愚蠢的分子?,核苷酸的简单排列,蛋白质的丰富多彩,A是B的DNA,这里B不是生物体A不是DNA这句话想说的是:A是B的本质、精华,核酸研究的历史,核酸研究的历史,不久，科塞尔（Albrecht Kossel）发现“核素”是蛋白和核酸的复合物，并明确了核酸各组成成分的比例(核酸化学领域的第一缕曙光),Friedrich Miescher,Albrecht Kossel(获1910年诺贝尔生理学医学奖),1869 米舍尔（Friedrich Miescher 从脓球分离出细胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名为“核素”

2、(nuclein),核酸研究的历史,1911 科塞尔的学生莱文(P.A.T.Levine）证明核酸中所含的糖由5个碳原子所组成，命名为核糖阐明了胸腺组织和酵母中分离到的核酸的不同,前者为脱氧核糖核酸(DNA),后者为核糖核酸（RNA）。,核酸研究的历史,1934 莱文发现核酸可被分解成含有一个嘌 呤或嘧啶、一个核糖或脱氧核糖和一个磷酸的片段，这样的组合叫“核苷酸”。他们根据当时比较粗糙的分析认为，4种碱基 在核酸中的量相等，从而错误地推导出核酸的基本结构是由4个含不同碱基的核苷酸连接成四核苷酸，以此为基础聚合成核酸，这就是较著名的“四核苷酸假说”。,核酸研究的历史,1944 美国微生物学家埃弗

3、里（O.T.Avery）等的肺炎球菌转化实验,O.T.AVERY,核酸研究的历史,Erwin Chargaff,1950 查伽夫（Erwin Chargaff）et al-Chargaff法则,核酸研究的历史,1952 赫尔希和蔡斯（HERSHEY,CHASE）-噬菌体标记实验,Alfred Hershey and Martha Chase,核酸研究的历史,1953 沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA双螺旋,Francis Crick and James Watson(获1962年诺贝尔生理学医学奖),Maurice Hugh Frederick Wilkins,Rosalind

4、 Franklin,为什么是这两个年轻人？,沃森：生物学，研究噬菌体克里克：物理学、化学不是因为勤奋（成绩平平），而是因为其独有的想像力。,沃森和克里克却是“站在巨人的脚趾上”-布拉格在为双螺旋写序时，戏称他们。,我之所以能够看得更远，是因为我站在巨人的肩膀上。-牛顿,“因为他们连跑上巨人的肩膀上功夫都没花”,核酸研究的历史,1955 托德(Alexander Robertus Todd)用磷酸三酯法合成了二核苷酸TpT 这是人工合成DNA大分子的前奏,Alexander Robertus Todd(获1957年诺贝尔化学奖),核酸研究的历史,1960年代中期 桑格(Sanger)的DNA测序

5、法,Frederick Sanger(获1958和1980年诺贝尔化学奖),核酸研究的历史,1972 伯格(Paul Berg)重组DNA技术 引起人肿瘤的猴病毒基因与噬菌体lambda的重组 1973 博耶（Herbert Boyer）和科恩（Stanley Cohen）-使用重组DNA技术首次得到了重组DNA微生物(基因工程技术),Paul Berg(获1980年诺贝尔化学奖),Herbert Boyer and Stanley Cohen,核酸研究的历史,1983 穆利斯（Kary Mullis)PCR技术,核酸研究的历史,1990 Human Genome Project,后基因组时代

6、-基因组学,功能基因组学 研究的核心问题有：基因组的多样性（SNP、药物基因组学）；基因组的表达及其时空调节（基因芯片、蛋白质组学等）；模式生物基因组研究（基因剔除）等,后基因组时代-基因组学,结构基因组学 结构基因组学，是由结构生物学与功能基因组学紧密结合所产生的，其科学目标就是要规模化地测定蛋白质、RNA及其它生物大分子的三维结构。,核酸的种类,DEOXYRIBONUCLEIC ACID（DNA）RIBONUCLEIC ACID（RNA）ribosome RNA(rRNA)transfer RNA(tRNA)messenger RNA(mRNA),核酸的分布,DNA RNA 核（%）98

7、90,核酸的含量,DNA恒定RNA与细胞生长状态有关,核酸的功能,DNA-遗传RNA-参与蛋白质合成,核酸的分子组成,元素组成 C H O N P（恒定，910%）基本结构单位核苷酸,n核苷酸（nucleotide),核酸多聚核苷酸（polynucleotides),磷酸,核苷（nucleoside),戊糖-ribose(R)deoxyribose(dR),碱基 A G U C A G T C,DNA、RNA组成异同,RNADNA 戊糖核糖脱氧核糖Adenine(A)Adenine(A)碱基 Cytosine(C)Cytosine(C)Uracil(U)Thymine(T)Guanine(G)

8、Guanine(G)链的数量常为单链双链 热稳定性?不稳定稳定,Adenine,Cytosine,Guanine,Thymine,核糖和磷酸,Deoxyribose,Phosphoric Acid,O,核苷、核苷酸,其它核苷酸:NAD(辅酶I)、FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)、cAMP、cGMP、5-FU、6-MP,2、3、5NMP(一磷酸核苷)，3、5dNMP，主要是5NMP、dNMP，DNARNA组成 NTPdNTP NDPdNDP 多磷酸核苷酸，能量代谢环核苷酸 cAMP、cGMP 第二信使NADNADP FADFMN 辅酶，生物氧化抗代谢药物 6MP，5-FU,核酸的分子结构,核酸的一级

9、结构,5 end,3 end,核苷酸的连接3,5磷酸二酯键,表示法 pCpCpA pC-C-A 5-CCA-3,DNA的分子结构,DNA的碱基组成（CHARGAFF法则）有种属特异性 无组织、器官特异性 不受年龄、营养和环境的影响 不论种属、组织来源，所有DNA分子 A T、G C A/T G/C 1 A+G T+C,DNA 的分子结构,Hydrogen Bonds,Cytosine,Adenine,Thymine,Guanine,Deoxyribose(Sugar molecule),Phosphoric Acid(Phosphate molecule),DNA的二级结构双螺旋结构,Wats

10、on,Crick（1953）在Chargaff法则及Wilkins,Franklin的X线衍射工作基础上提出DNA的double helix结构模型DNA分子由相互平行、走向相反、碱基互补的两条脱氧核糖核苷酸链围绕同一中心轴，盘绕成双螺旋结构，螺旋的一侧为大沟，另一侧为小沟。磷酸脱氧核糖形成的长链骨架在外，碱基在内，两平行链对应碱基间以氢键相连；对应碱基总是A=T、G=C配对（base pairing)或互补，形成稳定联系。各碱基平面垂直或基本垂直于双螺旋中心轴，链内碱基间形成纵向Vander Waals力与长轴平行，使双螺旋更稳定。相临碱基对间距离为0.34nm,每周螺距为3.4nm(10b

11、p),d为 2nm(B型）,DNA double helix类型,helix type bp/turn rotation/bp vertical rise/bp helical d A 11+34.7 2.56A 23A B 10+34.0 3.38A 19A C 9.33+38.6 3.32A 19A Z 12-30.0 5.71A 18A,DNA的高级结构,超螺旋 如线粒体DNA细菌质粒DNA病毒DNA,DNA的高级结构,核小体结构：由DNA和组蛋白共同构成 2(H2AH2B H3 H4)/DNA(146bp)=核心颗粒超螺线管染色质：由核心颗粒与连接区构成的核小体彼此串联，成串珠状，再进

12、一步卷曲，形成超螺线管结构。,RNA的分子结构,RNA的种类：tRNA、rRNA、mRNARNA的碱基组成：A U G C 稀有碱基（假尿嘧啶、甲基化碱基）RNA的一级结构：核苷酸序列 3,5磷酸二酯键连接RNA高级结构,tRNA的结构,一级结构 7090 nt 二级结构 三叶草形状：特点（1）氨基酸臂：3CCA-OH结构可与活化的氨基酸结合。（2）DHU环（二氢尿嘧啶）。（3）反密码环：可与mRNA中三联体构成反密码子，在蛋白合成中起解读密码子，将对应氨基酸引入合成位点的作用。（4）T环：含胸腺嘧啶核苷和假尿嘧啶核苷为特征。（5）额外环：是tRNA分类的标志 三级结构 倒“L”形,ACC,D

13、HU环,T环,反密码环,5,额外环,mRNA的结构,3-poly A(30200)，为mRNA的“尾”5-7甲基鸟苷三磷酸，为mRNA的“帽”分子中有编码区和非编码区。中间为密码子 Codon。这些三联体密码子决定蛋白质的一级结构,核酸的理化性质：含量和分子大小,细胞中核酸含量依种属及组织而定，如酵母含0.1%，肌肉组织及细菌含0.5%1%，在胸腺及精细胞中，含量高达1540%。分子大小可用长度、硷基对数目及分子量表示。长1m的DNA含3000硷基对，相当于分子量为2106 daltons。DNA分子大小测定的经典方法：超速离心测沉降系数（S）,核酸的理化性质：酸性化合物,两性但酸性强：DNA

14、、RNA在其多核苷酸链内既有酸性的磷酸基又有碱性的含氮杂环碱，因此核酸与蛋白质一样，也是两性电解质。因磷酸基的酸性较强故通常核酸表现为酸性。电泳行为泳向正极（pH7-8）：在中性或碱性溶液中，核酸带负电荷，在外加电场作用下向阳极移动。沉淀行为加盐（中和电荷）M+与磷酸“-”中和；乙醇：带负电荷的核酸可与金属离子成盐。当向核酸溶液中加入适当盐溶液后，带正电荷的金属离子即可将核酸的负离子中和，在有乙醇或异丙醇存在时核酸即可从溶液中沉淀析出。制备核酸时常用的盐溶液有氯化钠、醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵。,核酸的理化性质：降解,酸水解：DNA较RNA更敏感，N糖苷键断裂，嘌呤硷比嘧啶硷更不稳定硷水解：DNA

15、对硷稳定，硷水解多用于RNA。硷使RNA分子中磷酸二酯键的磷酸与C-5酯键水解断裂，生成2核苷酸与3核苷酸的混合物。酶降解：内切酶（胰DNase I)、外切酶（蛇毒磷酸二酯酶）,核酸的理化性质：高分子性质,粘度 DNARNA 核酸的分子量很大，核酸溶液具有较大的粘性。DNA分子的长度与其直径之比可达107，因此即使极稀的DNA溶液也有较大的粘度。RNA溶液的粘度较DNA为小。当核酸溶液受热或酸碱等因素作用下发生变性时，分子长度与直径比例减小，分子不对称性变小，溶液粘度下降。粘度测定可用作DNA变性的指标。,核酸的理化性质：高分子性质,超离心沉降 不同种类核酸分子的大小不同。核酸分子大小表示方法

16、有以下几种：即千道尔顿(kD)、碱基对(bp)或千碱基对(kb)数目、离心沉降常数(s)。离心沉降常数是利用高分子的核酸分子大小不同，分子形状不同，在超离心力场作用下的沉降行为也各不相同而测得。如真核生物核糖体小亚基中含的rRNA分子大小为18S，大亚基中的rRNA有28S、5S和5.8S三种分子。,核酸的理化性质：高分子性质,凝胶过滤 高分子的核酸还表现为特异的凝胶过滤(如葡聚糖凝胶)洗脱行为，洗脱时分子量大的先被洗出，分子量小的后洗出。,核酸的紫外吸收,核酸中的嘌呤硷、嘧啶硷及其组成的核苷、核苷酸及核酸对紫外光都有强吸收作用。其共同特点是对在260nm处的紫外光有最大的吸收值。低色效应（H

17、ypochromic effect）：DNA双螺旋松散后，所得的光吸收值几乎是其组成中所有核苷酸光吸收值的总和。双螺旋重新形成时，硷基间氢键的连系及硷基对间的万德华氏力作用，可使260nm处的紫外光吸收值下降。核酸分子中硷基的克分子数与磷的克原子数相等，可根据核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值来测定核酸量。换算：1 OD260nm 双链DNA=50 g/ml 1 OD260nm 单链DNA=37 g/ml 1 OD260nm 单链RNA=40 g/ml,变性、复性与杂交,核酸在理、化因素作用下，双螺旋结构破坏称核酸变性。根据变性因素区分为碱变性、热变性等。如DNA的碱变性、DNA的热变性，其中

18、以DNA的热变性更具典型意义,DNA的热变性,粘度改变，钢性线性分子变得无序，粘度下降,UV吸收增强，其规律如下：,高色效应 hyperchromic effect,核酸变性后、氢键破坏，双螺旋结构破坏，碱基暴露，紫外吸收（260nm）增强，谓高色效应,解链温度融解温度 melting temperature，Tm,UV吸收增值达到最大吸收增值50%时的温度，称Tm,Tm值与 DNA G+C含量有关，G+C含量愈大，Tm愈高，反之则低。与核酸分子长度有关，分子愈长，Tm愈高。,变性温度范围与DNA样品均一性有关，分子种类愈纯（单一），长度愈一致，其变性范围愈窄，反之则变性温度范围愈宽。,DNA

19、变性的复性 renaturation,DNA发生热变性后，经缓慢降温，如放置室温逐渐冷却，解开的互补链之间对应的碱基对再形成氢键，恢复完整的双螺旋结构，称DNA热变性的复性。核酸复性时UV下降，此称低色效应（hypochromic effect）,DNA热变性后缓慢冷却处理过程称退火 annealing,DNA加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，形成氢键联系，两链维持分离状态。,核酸分子杂交 hybridization,当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成碱基配对，出现复性现象，形成杂种核酸分子，或称杂化双链，称核酸分子杂交。,核

20、酸分子杂交,膜上固相杂交,杂交探针技术,采用一小段已知序列的单链(含数十个核苷酸)核酸，经同位素或其它小分子或发光物质标记其末端或全链，即为核酸探针(probe)。在适当条件或环境中与待测核酸样品杂交，通过放射性同位素自显影、显色、发光或荧光检测，判断待测的核酸分子是否含有与探针同源的核酸序列。探针技术已广泛用于分子生物学、分子遗传学基因分析及临床医学诊断，后者已发展为一门独立的新型学科DNA诊断学，又称基因诊断。,DNA的生物合成,DNA生物合成的概念 生物体内由DNAP催化合成DNA的过程，包括 DDDP指导的DNA合成复制 RDDP指导的DNA合成反转录 DDDP、重组酶或SOS系统酶参

21、与的DNA修复,DNA的复制合成,半保留复制概念 复制起始点（ori）和方向（5 3）复制体系E.coli为例 DnaB（识别ori）、解旋酶(Topo)、解链蛋白(Rep蛋白)、引发酶/前体、DNAPIII、DNAPI、DNA连接酶,半保留复制,DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制(replication)。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(semiconserv

22、ative replication)。,解旋、解链：DNA Topo酶和解链酶，松弛DNA超螺旋结构，形成复制叉 RNA引物合成：前导链在引发酶和引发前体合成RNA引物（1060nt)，随从链引物在引发酶和引发前体以及DnaA蛋白联合作用下。DNA链延长DNA聚合酶作用下 前导链 5 3连续合成 随从链冈琦片段 终止：DNA片段合成至一定长度后，链中的RNA引物即被核酸酶水解而切掉。此时出现的缺口由DNA的继续延长而填补，然后由DNA连接酶将这些片段再连接起来，形成完整的DNA链。,DNA复制过程,插入 DNA replication,反转录合成,反转录酶 RDDP活性 RNase活性 DDD

23、P活性 反转录过程及应用（PCR）cDNA合成RNA-DNA杂交体形成 RNA水解 双链cDNA合成,修复合成,DNA复制可能因碱基对错配而发生自发突变；在某些理、化或生物学因素(如电离辐射、紫外线、化学诱变剂或致癌病毒等)作用下，常可引起DNA链的损伤或突变。DNA损伤可有DNA的断链、链内交联和链间交链等；DNA的突变可分为点突变、缺失突变、插入突变和置换突变。细胞修复DNA损伤是通过一系列酶来完成的，这些酶可以除去DNA分子上的损伤，恢复DNA的正常结构。修复有多种方式。,切除修复(excision repair),重组修复(recombinational repair),SOS repair,谢谢！,