巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展.ppt
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1、巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展,生科院 杨军,宿主系统载体系统转化系统表达系统蛋白修饰与分泌系统,Content,一、前言,二、毕赤酵母简介,三、毕赤酵母表达系统,四、毕赤酵母表达系统优化,启动子选择外源基因的特性基因剂量mRNA的非翻译区翻译后修饰产物的稳定性发酵条件,五、前景展望,在过去的数十年中,遗传学家致力于DNA的鉴定和基因重组的研究,而重组有机体主要应用于蛋白质的生产。由于一些蛋白具有巨大的商业价值,因此大多数研究致力于寻找能够高效生产有功能蛋白的途径。随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展,诸多有应用潜力的蛋白分子有待开发,不同在蛋白在不同系统中表达水平有显著差异,目前应用的表达系
2、统包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等表达体系。其中酵母表达系统相对于其他表达系统有以下优点:不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题;并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。在酵母表达系统中,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,Pp)表达外源基因最理想。下面就巴斯德毕赤酵母表达的特点和研究进展作一简要综述。,前言,巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌,能够在低 廉的甲醇培养基中生长,甲醇能高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达,因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表
3、达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体,所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上,因此能够稳定遗传。目前已有500多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,二、巴斯德毕赤酵母简介,Pichia pastoris,甲醇代谢途径,目前广泛应用于外源基因表达和研究的毕赤酵母宿主菌有两种主要类型:营养缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌,三、毕赤酵母表达系统,宿主系统,营养缺陷型:,GS115(his4)最常用,此菌株的组氨酸脱氢酶基因突变,因此不能合成组氨酸,在不含组氨酸的培养基上不能生长,以此作为筛选标记。但由于自身合成蛋白酶对外
4、源蛋白有降解,因此产物存在不均一的问题。,其中KM71和SMD1168最常用,KM71(his4 arg4 aox1:SARG)的AOX1部分缺失,并且被S.cerevisiae的ARG4取代。因此AOX1(强启动子)基因不能编码醇氧化酶,只能依靠AOX2基因(弱启动子)编码醇氧化酶,因此KM71为甲醇利用缓慢型(Muts)。,蛋白酶合成缺陷型,SMD1168(pep4:URA3 his4 ura3)由于pep4部分缺失,不能合成蛋白酶A,而蛋白酶B和羧肽酶Y由蛋白酶A激活,因此可以有效减少对外源蛋白的降解。但生产缓慢,导致蛋白产量上不去。,载体系统,由于毕赤酵母没有稳定的游离型载体,故应用整
5、合型载体,通过同源重组整合到酵母染色体来实现稳定表达,整合位点一般是在AOX1或HIS4处,因此,载体上带有HIS4和AOX1基因的部分序列;还包括MCS和大肠杆菌复制所必需的元件,如复制起始位点,氨苄抗性基因;用于分泌表达的载体上还包括有信号肽序列。,General diagram of a p.pastoris expression vector.YFG,Your Favorite Gene;*,sites for cassette amplification,胞内表达型载体,分泌表达型载体,转化程序 重组子在酵母细胞中的命运用于转化子筛选的基因标记,转化系统,主要有三种方法:原生质体法:
6、早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法,在Ca2+和PEG的存在下,转化细胞可达原生质体总数的1-2%;离子溶液法:酵母的完整细胞经碱金属离子(如Li+等)、PEG、热休克处理后,也可高效吸收质粒DNA。103104个转化子/g DNA;电穿孔法(electroporation):酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA。105个转化子/g DNA。,转化程序,导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到染色体上,不同的整合方式可产生不同表型的转化子:(1)同源双交换:表达载体线性化后,两端分别为5AOX1和3AOX1序列,与基因组的同源序列发生双交换后,导致毕赤
7、酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换,胞内醇氧化酶只能来自AOX2基因,酶活性大大降低。因此转化子表现为甲醇利用缓慢,表型为Muts。,重组子在酵母细胞中的命运,(2)特异性的单交换:表达载体在5AOX1或3AOX1处线性化后,与染色体基因组中的相应序列发生同源重组,整合入AOX1基因的上游或下游。由于AOX1基因未被破坏,仍具有活性,所以转化子能正常利用甲醇,表型为Mut+,在甲醇为唯一碳源的培养基中正常生长。,通常有5%-10%转化子出现多拷贝整合,可用重组子上标记基因(如G418)来筛选多拷贝转化子,斑点杂交来测定外源基因拷贝数。一般情况下,整合的外源基因表达单元的拷贝数越多,表达
8、效率越高,可直接通过SDS-PAGE电泳来测定外源蛋白表达量。此外也可利用同尾酶体外构建多拷贝重组子。,若整合发生在his4位点处,可能出现表达单元丢失现象,这可能是由于基因组中突变的his4与表达单元中的his4基因之间发生了基因转换(gene conversion)所致,所以一般选择AOX1位点整合。,his4,用于转化子筛选的基因标记,用于毕赤酵母转化子筛选的基因标记主要有营养缺陷型互补基因和显性基因:营养缺陷型互补基因主要氨基酸和核苷酸生物合成基因,如:HIS4,ARG4(精氨酸琥珀酸裂合酶),URA3(尿嘧啶合成酶基因)显性标记基因,如Zeocin,Blasticidin(灭瘟素),
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