巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展.ppt

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1、巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展,生科院 杨军,宿主系统载体系统转化系统表达系统蛋白修饰与分泌系统,Content,一、前言,二、毕赤酵母简介,三、毕赤酵母表达系统,四、毕赤酵母表达系统优化,启动子选择外源基因的特性基因剂量mRNA的非翻译区翻译后修饰产物的稳定性发酵条件,五、前景展望,在过去的数十年中，遗传学家致力于DNA的鉴定和基因重组的研究，而重组有机体主要应用于蛋白质的生产。由于一些蛋白具有巨大的商业价值，因此大多数研究致力于寻找能够高效生产有功能蛋白的途径。随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展，诸多有应用潜力的蛋白分子有待开发，不同在蛋白在不同系统中表达水平有显著差异，目前应用的表达系

2、统包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等表达体系。其中酵母表达系统相对于其他表达系统有以下优点：不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题；并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。在酵母表达系统中，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris,Pp)表达外源基因最理想。下面就巴斯德毕赤酵母表达的特点和研究进展作一简要综述。,前言,巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能够在低 廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表

3、达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,二、巴斯德毕赤酵母简介,Pichia pastoris,甲醇代谢途径,目前广泛应用于外源基因表达和研究的毕赤酵母宿主菌有两种主要类型：营养缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌,三、毕赤酵母表达系统,宿主系统,营养缺陷型：,GS115（his4）最常用，此菌株的组氨酸脱氢酶基因突变，因此不能合成组氨酸，在不含组氨酸的培养基上不能生长，以此作为筛选标记。但由于自身合成蛋白酶对外

4、源蛋白有降解，因此产物存在不均一的问题。,其中KM71和SMD1168最常用，KM71（his4 arg4 aox1:SARG）的AOX1部分缺失，并且被S.cerevisiae的ARG4取代。因此AOX1（强启动子）基因不能编码醇氧化酶，只能依靠AOX2基因（弱启动子）编码醇氧化酶，因此KM71为甲醇利用缓慢型（Muts）。,蛋白酶合成缺陷型,SMD1168（pep4:URA3 his4 ura3）由于pep4部分缺失，不能合成蛋白酶A，而蛋白酶B和羧肽酶Y由蛋白酶A激活，因此可以有效减少对外源蛋白的降解。但生产缓慢，导致蛋白产量上不去。,载体系统,由于毕赤酵母没有稳定的游离型载体，故应用整

5、合型载体，通过同源重组整合到酵母染色体来实现稳定表达，整合位点一般是在AOX1或HIS4处，因此，载体上带有HIS4和AOX1基因的部分序列；还包括MCS和大肠杆菌复制所必需的元件，如复制起始位点，氨苄抗性基因；用于分泌表达的载体上还包括有信号肽序列。,General diagram of a p.pastoris expression vector.YFG,Your Favorite Gene;*,sites for cassette amplification,胞内表达型载体,分泌表达型载体,转化程序 重组子在酵母细胞中的命运用于转化子筛选的基因标记,转化系统,主要有三种方法：原生质体法：

6、早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%；离子溶液法:酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。103104个转化子/g DNA；电穿孔法(electroporation)：酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA。105个转化子/g DNA。,转化程序,导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：（1）同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5AOX1和3AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤

7、酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换，胞内醇氧化酶只能来自AOX2基因，酶活性大大降低。因此转化子表现为甲醇利用缓慢，表型为Muts。,重组子在酵母细胞中的命运,（2）特异性的单交换：表达载体在5AOX1或3AOX1处线性化后，与染色体基因组中的相应序列发生同源重组，整合入AOX1基因的上游或下游。由于AOX1基因未被破坏，仍具有活性，所以转化子能正常利用甲醇，表型为Mut+，在甲醇为唯一碳源的培养基中正常生长。,通常有5%-10%转化子出现多拷贝整合，可用重组子上标记基因（如G418）来筛选多拷贝转化子，斑点杂交来测定外源基因拷贝数。一般情况下，整合的外源基因表达单元的拷贝数越多，表达

8、效率越高，可直接通过SDS-PAGE电泳来测定外源蛋白表达量。此外也可利用同尾酶体外构建多拷贝重组子。,若整合发生在his4位点处，可能出现表达单元丢失现象，这可能是由于基因组中突变的his4与表达单元中的his4基因之间发生了基因转换（gene conversion）所致，所以一般选择AOX1位点整合。,his4,用于转化子筛选的基因标记,用于毕赤酵母转化子筛选的基因标记主要有营养缺陷型互补基因和显性基因：营养缺陷型互补基因主要氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：HIS4,ARG4（精氨酸琥珀酸裂合酶）,URA3(尿嘧啶合成酶基因）显性标记基因，如Zeocin，Blasticidin（灭瘟素）,

9、G418,表达系统,信号肽对分泌表达效率的影响,毕赤酵母启动子的可控性,常用的启动子有诱导型和组成型。诱导型启动子包括：PAOX1、PFLD1、PICL1组成型启动子：PGAP（1）PAOX1：是由甲醇诱导的强启动子，也是毕赤酵母表达中使用最广泛的启动子，AOX1基因是利用的甲醇的第一个酶基因，它的表达是在转录水平被调控的。具有以下优势：以甲醇作为唯一碳源时，才能诱导AOX1的表达，因此可严密调控外源蛋白的表达。可以高效表达外源蛋白。,毕赤酵母启动子的可控性,缺点：甲醇添加时间和添加量不好掌握；甲醇易燃，大量储存危险性大；甲醇为石油化工原料，因此不适宜生产食用蛋白。（2）PFLD1：FLD（F

10、ormaldehyde dehydrogenase）是甲醛脱氢酶基因，是甲醇代谢途径中的另一关键酶，同时参与甲胺代谢。FLD1基因既可受甲醇诱导，又可以受甲胺诱导。,因此它利用甲醇或甲胺诱导PFLD1表达外源蛋白，当用甲胺诱导时，葡萄糖或甘油可代替甲醇做为碳源。其严格调控和转录效率与PAOX1相当。Resina等发现用甲醇和甲胺共诱导PFLD1与单纯用甲醇诱导相比，外源蛋白Rhizopus oryzae lipase（稻根霉菌脂肪酶）的表达量有所提高。（3）PICL1：柠檬酸裂合酶启动子是一种能以甲醇为唯一碳源诱导型启动子，它能够在毕赤酵母中高效表达葡聚糖酶。但是，关于它能否在毕赤酵母中启动外

11、源蛋白表达及其诱导表达条件，还需要进一步的研究。,（4）PGAP：是一种组成型表达启动子，不需甲醇，操作简单，诱导外源蛋白的表达量与PAOX1相当。但不适宜表达对毕赤酵母有毒性作用的蛋白。,因毕赤酵母只能识别很少的外源蛋白信号序列,所以更多的是利用酵母的同源信号序列,如来自毕赤酵母的酸性磷酸酶信号序列（PHO1)和酿酒酵母的交配因子前导肽（-Factor prepropeptide），其中交配因子前导肽应用最广泛。,信号肽对分泌表达效率的影响,-Factor prepropeptide:来自酿酒酵母，由19个氨基酸残基的前体序列和66个氨基酸的残基的前导肽序列组成，其中前导肽序列中含有三个N-

12、糖基化位点和一个Kex2蛋白内切酶位点，是目前应用最成功的信号肽。,信号肽结构的改变可能会提高分泌效率 Antonio等发现，改造了的信号肽大大提高了外源蛋白表达量。用经过修饰的人血清白蛋白天然信号肽可使HSA在毕赤酵母中的分泌提高几倍。Thomas 等将编码10个氨基酸连接肽的序列插入到-Factor与胰岛素前体基因之间，使胰岛素前体在毕赤酵母中的表达提高了3倍。,作为真核生物，毕赤酵母可以进行类似哺乳动物细胞的蛋白翻译后修饰，如信号肽加工，蛋白折叠，二硫键形成和糖基化修饰等,蛋白修饰与分泌系统,毕赤酵母中外源糖蛋白的糖基化：酵母菌中的蛋白糖基化修饰有两个主要步骤，即在内质网膜内腔中的寡聚多

13、糖核装配以及在高尔基体中的糖外链延伸。糖基分为两种类型：O-糖基和N-糖基。O-寡聚多糖只有甘露糖，但许多高等真核生物的蛋白在相同的糖基化位点上都含有唾液酸基团，而且糖基化位点也存在差异。N-寡聚多糖核与高等真核生物完全相同，但外侧链却有明显差异。而这种差异往往会导致蛋白生物活性下降、免疫原性增加等不良影响。,线性化重组载体,感受态菌株,平板筛选,PCR鉴定与筛选,MD和MM平板筛选,筛选多拷贝外源基因转化子,G418,表达鉴定与筛选,mRNA水平,蛋白表达水平,高效表达种子工程菌,发酵罐工艺建立,Muts和Mut+,技术路线：,根据启动子的特性选择 甲醇诱导型启动子如PAOX1，但甲醇易燃，

14、也不适用于食品生产，这时可选择PGAP,但不宜用于表达对宿主有毒的蛋白。强启动子可能产生无功能的蛋白 由于超过宿主自身翻译后修饰加工的能力，引起蛋白的错折叠、不加工或错定位。这是可选用较温和的启动子如PPEX8(一种过氧化物酶体基质蛋白启动子)。,四、毕赤酵母表达系统优化,启动子的选择,目的基因的碱基组成 基因富含A+T，会导致转录提前终止 种属特异性影响 稀有密码子制约翻译速率 此时需要进行全基因的合成，使编码序列符合毕赤酵母密码子的偏爱性和具有更高的G+C含量。,目的基因特性,相对剂量效应 一般情况下，随着整合拷贝数的增加，表达量也会增加，例如，1-8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量成比

15、例升高。但也有例外，如小牛溶菌酶的表达随着拷贝数从1-3的上升反而减少，这可能与mRNA翻译、蛋白折叠效率有关。过高表达对分泌途径抑制 对于分泌蛋白，过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制,基因剂量,UTR对蛋白表达的影响主要表面在mRNA的翻译水平上，目的蛋白mRNA5UTR应尽可能与AOX1mRNA相同。Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白mRNA与AOX1mRNA的5UTR相同后表达水平提高50倍以上。,mRNA5非翻译区,毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差异而具有潜在的抗原性，使其在医药工业上的应用受到一定的制约。它们在哺乳动物体内可被免疫系统清除而失去效能，而且有引起超

16、敏反应的危险性。解决糖基化策略：尝试胞内表达，避免目的蛋白的糖基化；对非活性中心的糖基化位点进行突变改造，清除糖基化；共表达糖链加工酶，使糖链结构接近哺乳动物，从而降低抗原性。,翻译后修饰,表达产物的稳定性 解决外源蛋白降解的三条基本途径：在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，增加蛋白酶的底物以减少对目的蛋白的降解；调节培养基PH值抑制蛋白酶活性；使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168、SMD1165等,温度：必须选择合适的温度。温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，但温度过高，又会使酶易因热而失去活性。pH值：毕赤酵母生长的pH值范围比较宽，因此应当选择适宜外源蛋白表达的p

17、H值。溶氧量：甲醇代谢过程中需要消耗大量氧，因此在发酵过程及时补充毕赤酵母代谢所需要的氧气对于外源蛋白表达量是至关重要的。甲醇的浓度和监测：在发酵过程中，需要定期补加一定量的甲醇以补偿甲醇的消耗和挥发。一般液体培养时，补加甲醇的终深度达到0.5%即可。但具体情况需要根据试验而定，同时可以根据溶氧和气象色谱控制甲醇流加。,发酵条件,近年来，毕赤酵母表达系统应用的范围越来越广，自20世纪80年代初到现在，人们已经用毕赤酵母表达体系成功表达了500多种蛋白，包括疫苗，激素、干扰素、抗菌肽、酶、膜受体蛋白等。但毕赤酵母表达系统也存在着一些问题，如蛋白的糖基化程度比哺乳动物偏大，影响蛋白的功能，另外，分泌产物表达不均一，信号肽加工不完全，表达产物降解等，这些都一定程度上限制了毕赤酵母的应用。但随着对发酵工艺的不断完善和对巴斯德毕赤酵母的深入研究，相信它将会成为表达外源蛋白的有力工具，充分发挥其在生物技术领域尤其是基因工程产品产业化方面的应用潜力。,五、前景展望,