大肠杆菌与合成生.ppt

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1、在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯,汇报人：马纳纳 2012年11月2日,合成生物学：,一门生物学与工程学交叉的前沿学科,以生命科学理论为指导,以工程学原理进行遗传设计、基因组改造(重组染色体)和（或）合成以及人造细胞合成。其中,基因组改造(重组染色体)和（或）合成是关键。2010年5 月20日,以克雷格文特尔为首的美国科学家,在Science上公布了人类历史上创造出首个“人造单细胞生物”的消息，以这项成果为代表的合成生物学(synthetic biology,Synbio)也就受到了前所未有的关注。,合成生物学如何创造生命,用A、G、C、T 为代表的化

2、学物质人工合成DNA(脱氧核糖核酸)片段,由DNA片段合成基因,再由基因组合成生物模块,然后装配成“人造基因组”,最终在实验室里创造出全新生物体。,合成生物学与大肠杆菌,合成生物学中的底盘生物是合成生物学的“硬件”基础。大肠杆菌(Escherichia coli)作为最简单的模式生物，由于其背景清晰、生长快速、易于操作，在基础生物研究以及生物技术应用方面有着其他模式生物无可比拟的优越性。,大肠杆菌已经成为能源、化合物、材料及药物 生产的重要平台，合成生物学的发展促进了大肠杆菌代谢途径的重建，通过精确设计基因环路、重构代谢途径为大肠杆菌提供了新的代谢和生理功能，使其能够高产天然甚至非天然产物。在

3、过去的十年里，基于大肠杆菌的系统生物学得到了迅猛发展。,大肠杆菌与青蒿素的合成,青蒿素(artemisinin)是中国科学家于20世纪70年代从传统中草药青蒿或称黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离提纯的抗疟有效单体,其化学本质是含有“过氧桥”结构(1,2,4-三噁烷环)的倍半萜内酯。以青蒿素为母核经人工半合成获得的青蒿素琥珀酸酯(青蒿琥酯)、青蒿素甲醚(蒿甲醚)、青蒿素乙醚(蒿乙醚)和双氢青蒿素等青蒿素类药物,血中溶解性好,生物利用度高,对氯喹抗性疟疾及致命性脑型疟有特效,已成为世界卫生组织(WHO)倡导的“基于青蒿素的联合疗法”(artemisinin-based comb

4、ination therapies,ACTs)首选的抗疟新药。,青蒿分布地域狭窄,青蒿素含量低(0.01%0.5%).化学合成青蒿素产率不理想,成本高.随着全球疟疾发病率(3.8 亿人/年)和死亡率(4600 万人/年)逐年升高,青蒿素类抗疟药需求量迅猛增长,导致青蒿素原料药供不应求,市场价格飙升.近10年来,为了从根本上解决青蒿素的供需矛盾,国内外争相开展了青蒿素合成生物学及代谢工程研究,一方面尝试在微生物体内重建青蒿素生物合成途径,另一方面对青蒿中原有的青蒿素生物合成途径进行遗传改良,大肠杆菌与青蒿素前体,大肠杆菌内存在以脱氧木酮糖磷酸(Deoxyxylulose-5-phosphate，

5、DXP)途径为基础的类异戊二烯代谢途径，能合成少量的辅酶Q 等。故大肠杆菌非常适合作为生物合成类异戊二烯化合物的宿主菌。本研究在大肠杆菌中引入人工合成的紫穗槐-4,11-合酶基因并构建原核的粪肠球菌 Enterococcus faecalis 来源的MVA途径，获得了抗疟药青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯的高表达。这种微生物半合成青蒿素的方法先通过改造微生物合成途径获得青蒿素的前体紫穗槐-4,11-二烯或青蒿酸等，再采用相对简单的化学催化步骤可将这些前体转化成青蒿素，可以大规模制备青蒿素，解决资源短缺问题。,基本思路：首先在大肠杆菌Escherichia coli DHGT7 中引入人工合成的

6、紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸，成功获得了紫穗槐-4,11-二烯。为提高前体供给，引入粪肠球菌的甲羟戊酸途径，紫穗槐-4,11-二烯的产量提高了13.3 倍，达到151 mg/L。进一步研究发现了3 个限制酶，分别是紫穗槐-4,11-二烯合酶、HMG-COA 还原酶和甲羟戊酸激酶；通过调节这些酶的水平，紫穗槐-4,11-二烯产量提高了7.2 倍，在摇瓶中达到235 mg/L。,1.载体构建、目的基因表达,采用常用分子克隆技术，如PCR 扩增、酶切、连接和转化等构建质粒表达载体。,将表达载体转化宿主菌E.coli DHGT7，接入含相应抗生素(Kn、Cm 均为25

7、 g/mL)的液体LB培养基中，37 培养至OD600=0.30.4，加入 0.2 L-阿拉伯糖诱导，继续培养45 h。取菌体全蛋白作SDS-PAGE 分析,以 pET28a 为对照。结果在约56 kDa 处有可见的紫穗槐-4,11-二烯合酶(ADS)的条带。,2.摇瓶培养方法,挑取新转化的单克隆，接入含相应抗生素的液体LB 培养基中，37 振荡培养过夜。取过夜培养菌液转接40 mL 抗性FM2G 培养基，使初始菌体浓度为OD600=0.05，37、220 r/min振荡培养至OD600 为0.30.4 时，加入0.2 L-阿拉伯糖或0.5 mmol/L IPTG 诱导，并加入20(V/V)无

8、菌的十二烷覆盖在培养基的表面，随后转至30 继续培养4860 h。选取不同时间点测定菌体浓度和紫穗槐-4,11-二烯产量。,GC-MS法测定AD含量,新转化的菌株pET28-ADS/DHGT7 进行摇瓶培养，采用GC-MS法测定紫穗槐-4,11-二烯的含量。通过GC检测，分别在8.42 min和8.83 min 出现内标物石竹烯(IS)和紫穗槐-4,11-二烯(AD)的保留峰。,根据内标石竹烯的浓度对样品AD 含量进行定量，结果摇瓶培养48 h 的紫穗槐-4,11-二烯产量仅为11.3 mg 石竹烯当量/L。我们推测大肠杆菌内源的FPP 水平太低，限制了紫穗槐-4,11-二烯的产量，因此提高胞

9、内FPP 水平是提高紫穗槐-4,11-二烯产量的关键。由于大肠杆菌仅存在DXP途径，为避免对内源途径的影响，后面引入了异源的 MVA途径来提高前体供给。,3.构建异源MVA途径,以低拷贝质粒pACYCDuet-1 的骨架为基础，PCR 扩增质粒pET3b 的多克隆位点(MCS)，并通过PCR 引物引入Not和Apa 限制性酶切位点，将PCR 扩增的MCS序列连接到pACYCDuet-1 的Sph 和Eco R 之间，构建了具有特殊 MCS的质粒载体pAOC3ANL，用于多基因合成途径的构建。将粪肠球菌来源的mvaE、mvaS、MD 和ispA与ADS 分别构建在质粒载体pAOC3ANL 和pE

10、T28a上，得到表达载体pAOC3-ES-MD 和pET28-ispA-ADS，共转化E.coli DHGT7，摇瓶培养48 h，紫穗槐-4,11-二烯产量达到151 mg/L，是利用内源FPP的13.3 倍。,4.优化紫穗槐-4,11-二烯合成途径,将整个紫穗槐-4,11-二烯合成途径的基因构建 到单个质粒载体 pAOC3ANL 上，得到表达载体pAOC3-ES-MD-ispA-ADS(图4），转化E.coli DHGT7，紫穗槐-4,11-二烯产量为32.5 mg/L，仅为使用2 个质粒共表达时的1/5，菌体的生长也受到严重抑制(图5A)。,推断这是因为当使用2 个质粒共表达时ADS 是构

11、建在高拷贝的pET28a 上，而以单个质粒表达时 ADS 是构建在低拷贝的pAOC3ANL 上，间接地降低了ADS 的拷贝数，使得胞内FPP 累积，引起内源FPP 合成途径的反馈调控作用，从而抑制菌体生长。,提高ADS 的拷贝数，将pET28-ADS与pAOC3-ES-MD-ispA-ADS 共转化 E.coli DHGT7，结果紫穗槐-4,11-二烯产量提高了4.3 倍，达到140 mg/L(图5B)，菌体生长抑制也得到一定程度的缓解。,HMG-CoA 还原酶是类异戊二烯化合物生物合成过程中的关键酶，其活性不足会导致HMG-CoA 在胞内累积产生毒性。因此，我们提高HMG-CoA 还原酶水平

12、，构建了表达载体pET28-E-ADS，pAOC3 ES-MD-ispA-ADS 共转化E.coli DHGT7，结果菌体生长抑制得到进一步缓解，紫穗槐-4,11-二烯产量也再次提高。另外，提高胞内甲羟戊酸激酶(MK)的水平可以极大地提高紫穗槐-4,11-二烯产量。因此我们构建了表达载体pET28-E-MK-ADS，与pAOC3-ES-MD-ispA-ADS 共转化E.coli DHGT7，结果紫穗槐-4,11-二烯产量达到235 mg/L，是优化前的7.2 倍，菌体生长抑制基本消除。,结论,本研究利用大肠杆菌为宿主，构建异源紫穗槐-4,11-二烯从头合成途径，并对合成途径进行优化，通过提高紫

13、穗槐-4,11-二烯合酶、HMG-COA 还原酶和甲羟戊酸激酶等3 个酶的水平，消除了抑制菌体生长的不利因素，使紫穗槐-4,11-二烯产量达到235 mg/L。继续对培养基和培养条件等进行优化，或通过上罐发酵，将获得更高的紫穗槐-4,11-二烯产量。这为高效生物合成抗疟药青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯奠定了基础。,展望,近10 年来,青蒿素合成生物学进展速度惊人,通过微生物发酵生产青蒿素前体已接近工业化规模,但目前还不能实现青蒿素在微生物体内的全合成.国外拟采取“两步法”策略半合成青蒿素:第一步是在微生物中获得青蒿素前体,第二步是利用化学方法将青蒿素前体转变成青蒿素.该方法一旦实施成功并实现产业化,必将带来青蒿素生产方式的彻底变革,也是缓解日益严重的青蒿素短缺局面的根本出路.,谢谢大家！,