多糖分离纯化及含量测定.ppt

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1、多糖的分离纯化与含量测定,张黎明天津科技大学生物工程学院2013年4月29日,生物制药技术专题,主要讲授内容,一、多糖的提取方法二、多糖的纯化方法三、多糖含量的测定方法四、纯度与相对分子质量的检测polysaccharide;separation；extraction;isolationpurification;content determination;,前言,多糖在早期的天然产物化学研究中,因活性不明显,常作为无效成分弃去。由于化学、生物学、药理学等学科的飞速发展,自20世纪80年代来,人们对多糖的生物活性有了新的认识。,药理实验研究显示,多糖具有许多生物活性功能,包括免疫调节、抗肿瘤、降

2、血糖、降血脂、抗辐射、抗菌、抗病毒、保护肝脏等,且对机体毒副作用小。因此,对多糖的研究开发已成为医药保健品行业热门领域。,如香菇多糖、灵芝多糖、云芝多糖 已在国内外临床上广泛应用。而其他一些多糖正在深入研究,如桑黄多糖、猪苓多糖、人参多糖、枸杞多糖 等。,生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。,动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖；植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱

3、脂预处理。,一、多糖的提取方法,1.溶剂提取法 水提醇沉法、酸提法、碱提法、超临界流体萃取法2.酶解提取法 单一酶解法、复合酶解法3.强化提取法 超声波辅助提取法、微波辅助提取法、高压脉冲法,1.溶剂法：水提醇沉法,多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗漉，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置一定的时间，多糖的质量分数和得率均较高。,影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固

4、液比、提取时间以及提取次数等。该种方法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。,溶剂法：酸提法,为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解；含有胺基的多糖可使用乙酸或盐酸调节提取液成酸性进行提取，然后再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。,影响多糖提取率的因素有：水的用量、pH值、提取温度、浸提固液比、

5、提取时间以及提取次数等。由于H的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高；但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。,溶剂法：碱提法,有的酸性多糖,或分子量较大的多糖,在热水中溶解度不大,一般在稀碱溶液中溶解度较大,所以常用稀的NaOH 溶液或Na2CO3 溶液提取。不过用稀碱溶液提取时,提取温度必须保持在10 以下,否则多糖容易发生降解反应。多糖在碱性溶液中稳定，例如粘多糖的提取多采用碱提取法。,多糖碱法提取虽然可提高多糖的收率,且可缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质如蛋白质,粘度过大,

6、过滤困难,且有些多糖在碱性较强时会水解。通常先用热水法提取,然后残渣再用稀碱溶液提取,这样可将大部分多种类型的多糖提取出来。,溶剂法：超临界流体萃取法,超临界流体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，即密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。,超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。由于CO2 的超临界条件（TC31.26，Tp7.38 MPa）容易达到，常作为超临界萃取的溶剂，在压力为

7、840 MPa 时的超临界CO2 足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入夹带剂后则可溶解极性化物。,由于糖类的化合物分子量较大、羟基多、极性大，用纯二氧化碳提取产率较低，加入夹带剂或加大压力则可提高提取率。该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。,2.酶解法：单一酶解法,单一酶解法是指使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术。其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。,纤维素酶则能特异性地降解纤维素，使植物细胞的细胞壁破裂，有利于多

8、糖易从胞内释放。影响因素：酶种类和添加量、酶解温度()、酶解pH 值、水解时间、料液比有直接关系。,酶解法：复合酶解法,复合酶解法采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶，主要利用纤维素酶和果胶酶水解纤维素和果胶，使植物组织细胞的细胞壁破裂，释放细胞壁内的活性多糖，多糖释放的多少和复合酶的加入量、酶解温度、酶解时间、酶解pH 值及料液比有直接的关系。酶解法提取的实质是通过酶解反应强化传质过程。该法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。,3.物理强化法：超声波辅助提取法,超声波是频率高于20kHz的声波，它方向性好，穿透能力强，易于获得较集中的声能。超声波提取是利用超声波的机械效应、空化效应及

9、热效应。机械效应可增大介质的运动速度及穿透力，能有效的破碎生物细胞和组织，从而使提取的有效成分溶解于溶剂之中；,空化作用,形成高温和高压的环境,增加物质分子运动的频率和速度、溶剂的穿透力,从而加速目标成分进入溶剂,提高提取率。热效应增大了有效成分的溶解速度，这种热效应是瞬间的，可使被提取成分的生物活性尽量保持不变。影响因素有：超声波的频率、功率、温度、时间、料液比、超声波发生器的型式。,超声提取可极大地提高提取效率,节约溶剂,避免高温对提取成分的影响,与常规提取法相比,具有提取时间短、产率高、无需加热等优点。值得注意的是超声时间不宜过长,否则提取量反而下降,原因可能是由于超声处理时间过长,导致

10、多糖结构发生变化,糖链断裂,使多糖提取含量下降。,物理强化法：微波辅助提取法,微波是指波长在1mm到1m范围（相对频率为300 300000MHz）的电磁波，介于红外与无线电波之间。微波协助萃取植物药材时，一方面是利用微波透过萃取剂到达物料内部，由于物料腺细胞系统含水量高，水分子吸收微波能，产生大量的热量，所以能快速被加热，使胞内温度迅速升高，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞。,进一步加热，导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞或裂纹的存在使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内有效成分，再扩散到萃取剂中；,另一方面，在固液萃取过程中，固体表面的液

11、膜通常是由极性强的萃取剂所组成，在微波辐射作用下，强极性分子将瞬时极化，并以每秒2.45109次的速度做极性变换运动，这就可能对液膜层产生一定的微观“扰动”影响，使附在固相周围的液膜变薄，溶剂与溶质之间的结合力受到一定程度的削弱，从而使固液浸取的扩散过程所受的阻力减小，促进扩散过程的进行。,在微波协助浸取过程中，萃取剂种类、微波剂量、物料含水量、温度、萃取时间及pH值等都对萃取效果产生影响。其中，萃取剂种类、微波作用时间和温度对萃取效果影响较大。微波辅助提取多糖和其他的萃取方法比较，微波萃取效率高，操作简单，且不会引入杂质，多糖纯度高，能耗小，操作费用低，符合环境保护要求，是很好的多糖提取方法

12、。,物理强化法：高压脉冲法,高压脉冲法是对两电极间的流态物料反复施加高电压的短脉冲（典型为2080 kV/cm）进行处理。动物、植物、微生物的细胞，在外加电场作用下，产生横跨膜电位，绝缘的生物膜由于电场形成了微孔，通透性发生变化，当整个膜电位达到极限值(约为1V)时，膜破裂，膜结构变成无序状态，形成细孔，渗透能力增强。电位差达到临界点，细胞破裂。从而有利于多糖的提取。,二、多糖的分离纯化,1.除蛋白 Sevage 法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法2.色素的去除 吸附法（DEAE-纤维素、硅藻土等）、氧化法（过氧化氢）、离子交换法 3.多糖的纯化 超滤法、季胺盐沉淀法、柱层析法和色谱法等,1.除蛋

13、白,采用醇沉或其它溶剂沉淀得到的粗多糖中常含有较多的蛋白质,需要除蛋白。除蛋白的方法传统上有Sevage 法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等。,Sevage 法,根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V(氯仿)V(戊醇或正丁醇)为51 或41，混合物剧烈振摇2030 min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。一般按多糖水溶液的1/51/4体积加入。,此种方法只能除去少量蛋白质，须反复多次，多糖有损失，得率不高,且氯仿对人体也有一定毒性,操作时应注意。该法优点是条件温和,可避免多糖的降解。利用蛋白酶可水解蛋白质的特性,在多糖样品溶液中加入一些蛋白质水解酶如中性蛋

14、白酶和糜蛋白酶,再用Sevage 法效果更佳。此法不能除去脂蛋白，因为脂蛋白溶于氯仿。,三氯乙酸法,三氯乙酸是一种有机酸，使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。该法是在多糖水提液中滴加5%10%与多糖水提取液等体积的三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除去胶状沉淀，重复以上的操作直至溶液不再继续混浊为止，得无蛋白质的多糖。,三氯乙酸浓度越大，除蛋白质效果越好，但对多糖的影响也越大，可能是三氯乙酸对多糖结构具有破坏作用，使多糖降解，而且这种破坏作用随着三氯乙酸浓度增大而增强。,三氟三氯乙烷法,将多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温搅拌10 min 左右，离心分离得上层水层，水层继续用上述方法反

15、复处理几次，得无蛋白质的多糖溶液，此法效率较Seavg 法高，但溶剂沸点低，易挥发，不宜大量应用。,2.色素的去除,中草药来源的多糖,可能含有酚型化合物而颜色较深,这类色素大多呈负性离子,不能用活性炭吸附剂脱色,可以用弱碱性树脂DEAE-纤维素来吸附色素,这样不仅可以达到脱色的目的,而且可以进行多糖的分离。若多糖与色素结合,易被DEAE 纤维素吸附,不能被水洗脱,这类色素可用低温氧化法脱色，温度较高下氧化易引起多糖的降解。,对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖,可通过生成金属络合物的方法以同时除去蛋白和色素,方法是加入菲林试剂、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等与多糖生成不溶性络合物,经分离后用阴离子交

16、换树脂分解络合物得到多糖。,3.多糖的纯化,超滤法 季胺盐沉淀法 柱层析法 色谱法 其他方法,超滤法,膜分离技术（membrane separation technology，MST）是一种高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力（压力差、化学位差、电位差等），使原料液中组分有选择性的通过膜。目前应用较多的是超滤和微滤技术。如采用中空纤维超滤膜,对多糖去蛋白质后的提取液通过超滤去除小分子杂质。,季胺盐沉淀法,季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂,可与酸性糖形成不溶性沉淀,常用于酸性多糖的分离。当溶液的pH 值增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高,也会与中性多糖形成沉

17、淀。常用的季铵溴化物(CTAB)及其氢氧化物(CTA-OH)和十六烷基氯化吡啶(CPC),其浓度一般为1%10%(W/V),它们可在酸性、中性、微碱性和碱性中分级沉淀分离出酸性多糖。,柱层析方法,纤维素柱层析 阴离子交换柱层析 凝胶柱层析 亲和层析,纤维素柱层析,柱中的载体是纤维素。先用乙醇液将柱内纤维素平衡好,然后将多糖混合物全部沉淀于惰性的纤维素上面。用不同浓度乙醇水溶液(如80%,60%,40%,20%)梯度洗脱,则不同多糖就依次洗脱出来。先洗脱的是分子量最小的多糖,最终洗脱的是分子量最大的多糖。在洗脱过程中,由于各种多糖在柱上进行无数次的溶解和沉淀过程,最终将各种多糖分离开来。,这种方

18、法实质上与分步沉淀法相反,可称其为分步溶解法。其理论塔板数较高,所以流出液的纯度高。但该法的缺点是流速慢,纯化周期长,特别是对于粘度较大的酸性多糖,更显得流速过慢。,阴离子交换柱层析,至今应用最广泛的阴离子交换剂有二乙基氨基乙基纤维素(DEAE-cellulose),DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)及DEAE-琼脂糖(DEAE-Sepharose)三种,其中以DEAE-cellulose 应用得最广泛。DEAE-cellulose 具有开放性的骨架,多糖能自由进入载体中并进行迅速扩散。它有较大的比表面积,虽然其离子交换容量仅为0.70 0.75 mmol/g,但其对多糖的吸附量较

19、离子交换树脂大许多。,阴离子交换柱层析是目前多糖纯化中（也是柱层析中）应用最普遍的一种方法,特别是对于体积较大的多糖溶液,大多数首先采用阴离子交换柱层析。通过柱层析,多糖溶液得到浓缩及初步纯化(有的多糖通过该步骤即可得到各种均一多糖组分)。,由于纤维素上的离子交换基团较少,排列疏散且呈弱碱性,所以对大分子的吸附较弱,用一定离子浓度的盐就可将其洗脱下来。阴离子交换柱层析适合于分离各种酸性、中性多糖及粘多糖。它的分离机理包括离子交换,而更重要的是吸附与解吸附,所以其不仅可应用于中性多糖与酸性多糖的分离,也可应用于不同中性多糖的分离。,凝胶柱层析,它是根据多糖分子的大小和形状的不同即按分子筛的原理进

20、行分离的。凝胶柱层析在多糖的分离纯化上应用得很普遍。通常在获得粗多糖后,先用阴离子交换柱层析、透析、干燥,溶解后再用凝胶柱层析。凝胶柱层析是目前植物多糖最常用的高级纯化方法。,常用的凝胶有各种型号的交联葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel)三大类，以及后来在这些凝胶上进行性能改良的新一代凝胶,如Sephacryl、Superdex 和Superose 等。展开剂为各种浓度的盐溶液及缓冲溶液,离子强度最好不低于0.2 mol/L(否则拖尾严重)。,亲和层析,某些特定多糖具有和某些相对应的专一分子可逆结合的特性,如一种凝集素(刀豆球蛋白)

21、能专一地与分支多糖结合。分子之间的这种结合能力称为亲和力,使它们结合后再将其解离,可以纯化多糖。,把欲分离的可亲和的一对分子的一方作为配基(ligand)与不溶性载体结合使固定化,装入色谱柱(亲和柱),然后把含有欲分离的多糖溶液作流动相,这时溶液中只有能和配基具有亲和力的多糖分子被结合而吸附,其他多糖则流出柱外,然后再改变流动相的离子强度及pH,使配基与多糖解离,则被纯化的多糖就流出柱外。,其他方法,分级沉淀法 大多数活性多糖可溶于水，3 个碳以下的多糖还可溶于乙醇，随着聚合度的增大，多糖在乙醇中的溶解度逐渐降低。根据这一性质可在多糖的浓缩水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的体积浓度逐渐增加到50，

22、100，200，900 mL/L，从而使不同聚合度的多糖分别沉淀析出。,如在五味子多糖提取液中加入无水乙醇，使其体积分数分别达到10%，30%，45%，65%，进行分级沉淀，最后将剩余的母液直接蒸发浓缩，得到5 个分级的五味子多糖组分。,三、多糖含量的测定方法,多糖含量测定常规方法是以无水葡萄糖为对照品,采用苯酚-硫酸法,或者蒽酮-硫酸法。上述两种方法由于操作简单,试剂容易获得而在多糖含量测定中被广泛采用。,苯酚-硫酸法的原理,多糖在硫酸存在下先水解成单糖,再脱水生成具有呋喃环结构的化合物。由五碳糖生成的是糠醛,甲基五碳糖生成的是5-甲糠醛,六碳糖生成的是5-羟甲糠醛。糠醛酸在此条件下往往脱羧

23、,并生成糠醛。糠醛及其衍生物和苯酚缩合成有色物质,在480 nm 处有最大吸收,吸收值与糖的含量呈线性关系。,蒽酮-硫酸法的原理,蒽酮-硫酸法其原理是糖类与浓硫酸在沸水浴中迅速脱水生成糠醛或其衍生物,再与蒽酮试剂缩合,形成蓝绿色溶液,在620 nm 处有最大吸收,吸收值与糖的含量呈线性关系。,这两种方法也存在较为严重的缺陷:首先,葡萄糖是单糖,而植物多糖的组成是多样的,只用葡萄糖作为参照不确切;其次,显色试剂的不专属,单糖的干扰严重,实际上测得的结果是总糖的结果。在未严格纯化的植物多糖样品中,这种情况更为普遍。,为排除还原性单糖的干扰,可采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)比色法测定还原糖含量。

24、其原理是在碱性溶液中,3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物,在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。再将通过硫酸-苯酚法或者蒽酮-硫酸法得到的总糖结果减去还原糖,即得较准确的多糖含量。,糖醛酸含量测定,糖醛酸含量测定则以咔唑-硫酸法多见。该法的原理在于糖醛酸在硫酸存在下会与咔唑反应生成含羰基的紫红色产物。该产物在530 nm下有最大吸收,吸收值与糖含量呈线性关系。,四、纯度与相对分子质量的检测,纯度鉴定分子量的测定结构测定 包括多糖一级结构测定、多糖高级结构测定,纯度鉴定,多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均

25、一组分。多糖纯度鉴定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HPLC 法等。现在应用较多的是HPLC 法，旋光度测定也是纯度测定的一种方法。,分子量的测定,多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作。常用方法：渗透压法、蒸气压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电泳法、HPLC 法、超离心分析法、分子筛色谱法、GPC（凝胶渗透色谱）法、MALDITOFMS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）法。,结构测定多糖一级结构测定,多糖的一级结构分析，主要是分析组成多糖的单糖类型、数目、连接方式及苷建构型。常用化学法和仪器分析法。多糖组分与分子比例测定法：部分酸解法、

26、完全酶解法、色谱法；吡喃、呋喃环形式结构的分析：红外光谱；,连接次序：选择性光谱法、糖苷键顺序水解、核磁共振法、异头异构体：糖苷酶水解、核磁共振；羟基被取代情况：甲基化反应、气相色谱、过碘酸氧化、Smith 降解法和测硫酸基法(terho 法)、核磁共振法、质谱法;糖链、肽链连接方式：单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应；,多糖结构的分析方法很多，迄今没有一种方法可以单独完成多糖结构的分析。仪器分析与化学方法相结合是常用的多糖结构测定方法。,结构测定多糖高级结构测定,研究多糖的二级结构常用的手段是NMR 技术，如2DNMR，13C-NMR谱，通用的方法是将现代NMR 技术与理论计算相结合，通过一定的理论计算筛选构象，主要的理论计算方法有从头计算、丰度经验计算及经验力场计算。圆二色谱法（CD）也可用于糖的构象分析。,近年来，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活动的规律已达到前所未有的深度和广度，多糖作为一类重要的生物活性大分子其结构的研究势必推动对多糖的认识向深层次发展。,谢谢！,