外源表达产物的分离纯化.ppt

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1、A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则,10 外源基因表达产物的分离纯化,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,多种分离纯化技术的联合运用,合适分离纯化介质的选择,分离纯化过程的规模化,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在,纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；,采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；,采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选,用亲和层析进行纯化,表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶,菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白

2、。,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组蛋白应首选离子,交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；,重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析,纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合,适的范围内（10-8-10-4 mol/L）；,疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；,凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；,径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种,复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。,多种分离纯化技术的联合运用,在进行重组蛋白的纯化时

3、，通常需要综合使用多种技术，一般来,说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：,应选择不同分离纯化机理的方法联合使用,应首先选择能除去含量最多杂质的方法,应尽量选择高效的分离方法,应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段,合适分离纯化介质的选择,常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分,离纯化介质应具有下列性质：,对目标蛋白具有较高的分离效率,对目标蛋白不会造成变性,化学性能和机械性能稳定，重复性好,价格低廉,分离纯化过程的规模化,蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程,未必合适，如：,实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）,实验

4、室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）,因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。,B 离子交换层析,10 外源基因表达产物的分离纯化,离子交换层析的基本原理,离子交换介质的基本性质,离子交换层析的基本操作,离子交换介质的选择原则,离子交换现象,十八世纪中期由Thompson所发现，后来J.Thomas Way全面研究。1935年和Holmes研究合成了具有离子交换功能的高分子材料，第一批离子交换树脂。随后几年里又发展了多种类型离子交换树脂并在水处理方面得到应用。离子交换树脂的大发展主要是在二次世界大战以后。,离子交换树脂的发展,二战后美国和英国一些公司广泛进行了合成离子交换树

5、脂的研究工作，G.F.达莱利奥成功地合成了聚苯乙烯系、聚丙烯酸系阳离子交换树脂，这时，离子交换树脂已经成为一类新型高分子材料，人们认识到，用它可以比较简单地达到离子性物质的分离、纯化和浓缩的目的，而不求助于结晶和消耗热能的蒸发工艺。,离子交换树脂的发展,六十年代、七十年代，离子交换树脂的发展又有了重要突破，新的聚合方法的发明和一些大公司的加盟如美国的(Rohm and Hass)和德国的(Bayer)等为离子交换树脂的广泛应用开辟了新的前景。离子交换长期以来应用于水处理和金属的回收。在生物工业中，主要应用在抗生素、氨基酸、有机酸等小分子的提取分离上。近年来在蛋白质等生物大分子的分离提取也有应用

6、。,1942年毕业于西南联合大学1952年获美国印第安纳大学博士学位南开大学教授1980年当选为中国科学院院士开创并发展了我国的离子交换树脂和吸附工业，发明了大孔离子交换树脂，系统研究了新型离子交换树脂和大孔新型吸附树脂的合成、结构、性质及应用。,“离子交换树脂之父”何炳林,离子交换层析的基本原理,离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。,离子交换介质的基本性质,离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物,如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；,离子交换剂中所含的可解离基团在

7、水溶液中能与溶液中的其它阳,离子交换剂的基本性能,离子或阴离子起交换作用,如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗,脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数,吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去,电荷而解离下来,不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大,小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个,洗脱下来，达到分离纯化的目的,离子交换介质的基本性质,阴离子交换剂：强碱型和弱碱型,可电离的基团磺酸基（-SO3H）,离子交换剂的分类,磷酸基（-PO3H2）,羧酸基（-COOH）,酚羟基（-OH）,阳离子交换剂：强酸型

8、和弱酸型,可电离的基团伯胺基（-NH2）,仲胺基（-NHCH3）,叔胺基（-N(CH3)2）,季胺基（-N+(CH3)3）,(a)阳离子交换树脂,交换前,交换达到平衡后,（b）阴离子交换树脂,交换前,交换达到平衡后,离子交换介质的基本性质,离子交换剂的分类,强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽,弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小,弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子,交换能力逐渐减弱,弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子,交换能力逐渐减弱,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换树脂：,最常

9、见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯,乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物,离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，,因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换纤维素：,离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水,性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大,分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大,阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等,维素）,阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换葡

10、聚糖：,离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三,维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G）,Sephadex的优点如下：,亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核,酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小,电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快,既有离子交换作用，又有分子筛效应,因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换葡聚糖：,常用的离子交换葡聚糖包括：,阳离子交换剂CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50,Sephadex C-25，

11、Sephadex C-50,阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50,QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换琼脂糖：,离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B,DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）,尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因,的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点,此具有稳定的外形体积,离子交换介质的选择原则,一般而言：,酸性物质用阴离子

12、交换剂分离,氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化,碱性物质用阳离子交换剂分离,曲线来选择,离子交换介质的选择原则,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋白质净电荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pH pI（-）,对pI=5的某酸性蛋白质,在pH的范围内，,当蛋白质为阴离子时，,应首选DEAE纤维素；,在pH的范围内，,当蛋白质为阳离子时，,应首选CM纤维素,离子交换层析的基本操作,层析柱平衡,平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍,平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速,平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致,为准，其中pH

13、值最重要,离子交换层析的基本操作,样品进柱,为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%,为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高,交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数,离子交换层析的基本操作,样品洗脱,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子浓度,离子强度,pH值,Starting conditions,Adsorptions on sample substances,Start of desorption,End of desorption,regenerations,带有相反电荷的大分子：在吸附

14、阶段可与担体上的离子基团结合,带有相反电荷的小分子：在洗脱阶段与吸附的大分子竞争，顶替出来,功能基团,骨架,活性离子,担体：接有离子基团，担体本身应该是惰性的,离子基团：连接在担体上，为层析剂的活性基团，可与相反离子结合,C 凝胶层析,10 外源基因表达产物的分离纯化,凝胶层析的基本原理,凝胶介质的基本性质,凝胶层析的基本操作,凝胶介质的选用原则,凝胶层析的基本原理,凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合,物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛,分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之,外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们

15、,下行速度快,分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙,即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢,鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定,以及分离纯化。,凝胶介质的基本性质,葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G,150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升,葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解,湿态的葡聚糖可加热到110，干的则能耐受120高温,葡聚糖凝胶（Sephadex）,Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既,可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适

16、用于非水溶性溶,质的凝胶过滤,凝胶介质的基本性质,琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose,（Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比）和Bio-Gel-A等,（Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排,阻限度。,琼脂糖凝胶,当温度高于50时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。,琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大,分子物质（如蛋白质和DNA）。,Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围,与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。,凝胶

17、介质的基本性质,聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联,而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交,联剂越多，孔隙越小。,聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种,聚丙烯酰胺凝胶,（数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）,凝胶介质的选用原则,将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分,离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。,组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量,的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G-,组别分离,1

18、5、Bio-Gel P-2或P-4,凝胶介质的选用原则,将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离,该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。,分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶,在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由,分级分离,于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。,凝胶层析的基本操作,平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速,注意凝胶的断层和气泡,层析柱平衡,操作压控制,平衡和洗脱时应维持流速恒定,恒定的操作压是恒流的先决条件,凝胶层析的基本操作,上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：,进样体积,进行组别分离时，样品

19、溶液最大可为柱体积的10%,进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能,窄，这样洗脱出的峰形好,D 亲和层析,10 外源基因表达产物的分离纯化,亲和层析的基本概念,亲和层析载体的性质与选择,亲和层析配基的性质与选择,亲和层析的基本操作,亲和层析的基本概念,亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力,进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：,纯化过程简单、迅速，且分离效率高,特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子,亲和层析的基本特点,纯化倍数大，产物纯度高,必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件,因此应用范围受到一定的限制,亲和层析的基本概念

20、,抗原与抗体,DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA),酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子,激素或药物与其受体,具有特异性亲和作用的生物分子,维生素于其特异性结合蛋白,糖蛋白与其相应的植物凝集素,亲和层析的基本概念,亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连,作为固定相吸附剂,当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有,和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结,亲和层析的基本原理,合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出,然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来,亲和层析载体的性质与选择,具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过,具有良好机械

21、性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速,亲和层析载体的选择,具有惰性，尽量减少非专一性吸附,具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合,偶联,在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性,亲和层析载体的性质与选择,纤维素,葡聚糖凝胶,常用的亲和层析载体,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,其它新型载体,亲和层析配基的性质与选择,纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力,但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的,亲和层析配基的选择,条件就要强烈，这样可能使生物分子变性,配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物,分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配,基与生物分子

22、之间的亲和力,亲和层析配基的性质与选择,酸酐法,N-取代羟基琥珀酰亚胺法,配基的偶联,叠氮化作用,还原性烷基化合物（西夫碱）的形成,亲和层析的基本操作,通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等使与固定配,泛的是改变溶液的离子强度。,非专一性洗脱,化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低,基结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广,非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发,生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定,亲和层析的基本操作,使用特异的配基作为洗脱剂,溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗,专一性洗脱,使用含有与亲和配基

23、或目标产物具有亲和作用的小分子化合物,脱目标产物,亲和层析的基本操作,亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载,性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法,特殊性洗脱,体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。实际上特殊,E 膜分离,10 外源基因表达产物的分离纯化,膜分离的基本原理,分离膜的主要性能,影响膜分离的因素,概述 近20年发展起来的膜分离技术，已广泛用于生物工程、食品、医药、化工等工业生产及水处理等各个领域；膜分离技术是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。膜分离技术它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率

24、高和节省能量等优点，已作为一种单元操作日益受到人们极大重视。,膜分离(membrane separation),概述1925年以来，差不多每十年就有一项新的膜过程在工业上得到应用30年代 微孔过滤40年代 渗析50年代 电渗析60年代 反渗透70年代 超滤 80年代 气体分离90年代 渗透汽化现代 EDI技术,膜分离过程(membrane separation),概述1960年Loeb和Sourirajan制备出第一张具有高透水性和高脱盐率的不对称反渗透膜，是膜分离技术发展的一个里程碑。自此以后，不仅在膜材料范围上有了极大扩展，而且在制膜技术、组件结构及设备研制方面也取得了重大进展。,膜分离过

25、程(membrane separation),膜分离的基本原理,膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为,化，它是一种物质被透过或被截留的过程，近似于筛分过程，依据滤,膜分离的基本定义,推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。,膜分离是利用具有一定选择性透过特性的介质进行物质的分离纯,膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的,膜分离的基本原理,分子级别的分离过程，分离效率高,膜分离的特点,不涉及相变，能耗低，运行成本低,膜分离为单纯物理变化，无二次污染,膜分离的基本原理,分离膜的选择通透性：是物质分离的第一机制,膜分离过程的重要参数,膜分离过程的推动力：静压

26、力差、浓度差、电位差,物质通过分离膜的速度：是物质分离的第二机制,膜分离的基本原理,根据分离膜膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可,膜分离的主要类型,反渗透（Reverse osmosis RO）,透析（Dialysis DS）,分成下列几类：,超滤（Uitrfiltration UF）,微滤（Microfitration MF）,电渗析（Electrodialysis EI）,膜分离的基本原理,透析（Dialysis DS）,膜分离的主要类型,透析过程使用一种只透过溶剂而不透过溶质的膜，一般称为理,当把溶剂和溶液（或把两种不同浓度的溶液）分别置于此两侧,想的半透膜,时，纯溶剂将自然穿

27、过半透膜而自发地向溶液（或从低浓度向高浓,度）一侧流动，这种现象叫渗透,膜分离的基本原理,反渗透（Reverse osmosis RO）,膜分离的主要类型,反渗透其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质,溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、,不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中的,苦咸水淡化和产纯水制备等方面,膜分离的基本原理,超滤（Uitrfiltration UF）,膜分离的主要类型,超滤是一种根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相,相应的截留分子量范围从500到100万左右。,对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围1 nm-0

28、.1 mm，,分离膜的基本性能,分离膜是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括分离透过,性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电,性能和化学物理性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热,性能、毒性、机械强度等。,膜的化学物理性能,分离膜的基本性能,微滤膜0.025-14 mm,反渗透膜0.0001-0.001 mm,超滤膜0.001-0.02 mm,纳米过滤膜平均孔径 2 nm,膜的分类,按膜的孔径大小分类：,分离膜的基本性能,对称性膜膜截面上的孔道结构均匀,不对称性膜由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成,膜的分类,按膜的结构分类：,传质阻力大，透过通量低，易污染

29、、难清洗,传质阻力小，透过通量高，被广泛使用,分离膜的基本性能,天然高分子膜 醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素,合成聚合物膜 聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物,膜的分类,按膜的材料分类：,无机材料膜 陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素,将膜固定在合适的支撑物上即构成膜组件，商品化的膜组件有：,管式、板式、螺旋圈式、中空纤维（毛细管）,影响膜分离的因素,影响膜分离效率的主要因素是膜的污染，其表现形式是：,溶质在膜孔内吸附,造成膜污染的主要原因是：,蛋白质在不同pH条件下所带电荷对膜电荷的相互作用,无机盐通过形成复合物、改变溶液离子强度等机制污染膜,溶质在膜表面沉淀或结晶,膜分离过程中体系的粘度增大会污

30、染膜,F 原核生物表达的重组蛋白质量检测,10 外源基因表达产物的分离纯化,工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。,重组蛋白的质量控制指标包括：,重组蛋白的鉴别（序列）,重组蛋白的纯度（杂质的类型）,重组蛋白的活性（检测方法）,重组蛋白的安全性,重组蛋白的稳定性,重组蛋白的一致性（构象与构型）,原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法,检测项目,检测方法,产品是否含内毒素家兔热原法,蛋白质是否变异肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳,甲硫氨酸是否被甲酰化肽谱、质谱、HPLC、Edman分析,蛋白质是否变性、聚合、脱氨基SDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质,配体是否脱落SDS-PAGE、免疫分析,氨基酸是否发生取代氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳,产品是否被细菌、病毒、支原体等污染微生物学检测,谱、HPLC、毛细管电泳、Edman分析,D 亲和层析,10 外源基因表达产物的分离纯化,C 凝胶层析,B 离子交换层析,A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则,F 原核生物表达的重组蛋白质量检测,E 膜分离,