基因工程生物化学.ppt

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1、,2 nm,大沟(2.2 nm),小沟(1.2 nm),3.4 nm,DNA 双螺旋结构要点(Watson 和 Crick，1953)1.DNA 由两条反相平行的脱氧核苷酸链 组成，脱氧核糖-磷酸骨架位于双链的 外侧，碱基位于内侧，双链的碱基之 间以氢键相结合。碱基互补配对形式：A T；G C)2.DNA 是右手螺旋结构，螺旋直径为 2 nm，螺距为 3.4 nm。碱基平面垂直螺 旋轴，相邻碱基平面距离为 0.34 nm，螺旋一圈包含 10 对碱基。3.氢键维持 DNA 双链横向稳定性，碱基 堆积力维持双链纵向稳定性。,DNA双螺旋解开成为单链，用于合成新的互补链.,子代DNA双链中一股单链是

2、从亲代完整地接受过来另一股单链按碱基配对原则完全重新合成,半保留复制,DNA复制的酶及蛋白因子,1.底物 dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶 DNA聚合酶（DNA依赖的DNA 聚合酶)DNA-pol3.模板单链的DNA母链4.引物寡核苷酸引物（RNA)5.其他酶和蛋白质因子 拓扑异构酶、单链DNA结合蛋白，连接酶 解旋酶、引物酶 多种蛋白因子,DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA-pol）以DNA为模板，催化3，5-磷酸二酯键的形成,DNA连接酶,基因工程(Genetic engineering),(Central dogma),基因(Gene)能编码一

3、条多肽链并具有一定长度的 DNA 分子。基因组(Genome)一种生物全部染色体的遗传物质的总和，以全长 DNA 的碱基对(bp)数目表示。,细菌基因组大肠杆菌：4 x 106 bp,人类基因组：3 x 109 bp,克隆(Clone)指用无性繁殖方法产生一组遗传上相同的细胞和生物群 体过程。这些细胞或个体均来自无性繁殖单一原形细胞。分子克隆(Molecular cloning)利用 DNA 重组技术可使一个基因或 DNA 片段产生出许多 相同的拷贝。DNA 重组技术(Recombinant DNA techniques)利用限制性内切酶、连接酶等在体外将不同生物体的 DNA 片段进行重新组合

4、的技术。重新组合在一起 DNA片段称作 重组 DNA 分子。,基因组 DNA,克隆载体,限制性内切酶消化,限制性内切酶消化、电泳分离、纯化,DNA 连接酶,重组载体,转化或转导,大肠杆菌宿主细胞,细胞增殖,分子克隆的基本过程,重组载体在大肠杆菌宿主细胞中复制以产生许多相同的分子拷贝,基因组 DNA,载体(环状 DNA),可被克隆的 DNA 片段,线状 DNA 载体,筛选含目的基因的重组子,限制性内切酶,限制性内切酶,转化或转导大肠杆菌,重组 DNA 分子,组 织,mRNA,cDNA,部分或全部酶切的 DNA,加衔接物分子,DNA 连接酶,反转录,工具酶 载体 目的基因 基因组 DNA 文库筛选

5、 PCR 产物 cDNA文库筛选 RT-PCR 产物 化学合成 宿主细胞 导入重组 DNA 分子到宿主细胞 筛选携带目的基因的宿主细胞,分子克隆的所需的条件,工具酶1.限制性内切酶和修饰酶(Restriction endonucleases and modifying enzymes),一类存在于细菌中的核酸内切酶，它们识别双链 DNA 分子上特异的核苷酸序列，并对 DNA 分子进行剪切。“限制性”只降解外源 DNA 而不降解宿主 DNA；细菌存在甲基化酶，对限制性内切酶识别序列中腺苷酸和胞苷酸进行甲基化而不被限制性内切酶所剪切。这就构成了细菌的“限制-修饰系统”的分子基础。“内切酶”是指酶切

6、位点在 DNA 分子内，而不是两端。,限制性内切酶(Restriction endonucleases),限制性内切酶的分类,回文结构(palindrome)是双链 DNA 分子中的反向重复结构，即每条链从 5 3 方向读其核苷酸序列都相同。5 GGATCC 3 5 GGA TCC 33 CCTAGG 5 3 CCT AGG 5 5 AGATCT 33 TCTAGA 55 CCCGGG 33 GGGCCC 5,命名属名(genus)的第一个字母，用大写表示种名(species)的前两个字母，用小写表示细菌株名(strain)，用大写或小写表示同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用

7、罗马字表示。,类型 II 限制性内切酶,同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示,属名(大写),EcoRI,种名(小写),细菌株名(大写),Escherichia 属,coli 种,R株,识别序列,(1)具有回文结构BamHI5 GGATCC 33 CCTAGG 5KpnI5 GGTACC 33 CCATGG 5(2)具有间断的回文结构HinfI(XmnI)5 GANTC 33 CTNAG 5(3)具有简并性碱基HincII5 GT(T/C)(A/G)AC 33 CA(A/G)(T/C)TG 5(4)无回文结构MboII5 GAAGA(N)8 33 CTTCT(N)7 5

8、,GAATTCCTTAAG,CTTAA,5-3-,-3-5,5-3-,-3-5,G,AATTC,G,5 P-3 OH-,-OH 3-P 5,CTGCAGGACGTC,5-3-,-3-5,CTGCA,5-3-,G,-OH 3-P 5,ACGTC,5 P-3 OH-,G,-3-5,EcoRI,PstI,经限制性内切酶酶切后所产生的末端类型(1)粘性末端(sticky ends,cohesive ends),5 凸端(5 overhang)粘性末端,3 凸端(3 overhang)粘性末端,CCCGGGGGGCCC,5-3-,-3-5,5-3-,-OH 3-P 5,CCCGGG,GGGCCC,5 P

9、-3 OH-,-3-5,SmaI,-3-5,5-3-,5-3-,-OH 3-P 5,GGCC,5 P-3 OH-,-3-5,CCGG,GGCCCCGG,HaeIII,(2)平端或钝端(blunt ends),同尾酶（isocaudarner）限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,不同的酶可以产生同样的末端,+,Bam H,+,Bst,+,Xma,+,Sma,能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶互称同工异源酶（isoschizome

10、r）或同裂酶。,不同的酶可以识别同一个序列,酶活性单位：在 37C(某些限制性内切酶用 25C 或 50C)条件下，每1小时酶切 1 g DNA 所用的酶量。,类型 II 限制性内切酶的反应条件,常用的酶反应体系为 50 l，即10X 缓冲液5 lDNA2 gddH2O42.5 l限制性内切酶(10U/l)0.5 l,T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)去除核酸分子末端的磷酸基团DNA 聚合酶 I 大片段(Klenow)T4 DNA 聚合酶(T4 DNA polymerase)合成DNAT7 DNA 聚合酶(T7 DNA po

11、lymerase)Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)逆转录酶(Reverse transcriptase)以RNA为模板合成cDNA末端脱氧多核苷酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase)给DNA末端加尾以构成黏性末端多核苷酸激酶(Polynucleotide kinase)5羟基末端磷酸化DNA 核酸酶 I(DNA nuclease I)S1 核酸酶(S1 nuclease)外切核酸酶 III(Exonuclease III)外切核酸酶(Exonuclease),2.修饰酶(Modifying enzymes),T4 D

12、NA 连接酶,ATP,TGCTTAA,5-3-,ACG,-OH 3-P 5,AATTCGT,GCA,-3-5,5 P-3 OH-,TGCTTAA,5-3-,ACG,AATTCGT,GCA,-3-5,T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)催化 DNA 的 3-OH 和 5-P 之间形成磷酸二酯键,连接带粘性末端的两个 DNA 分子,T4 DNA连接酶,ATP,ACG,5-3-,TGC,-OH 3-P 5,TAGCCGT,ATCGGCA,-3-5,5 P-3 OH-,5-3-,TGCTAGCCGT,ACGATCGGCA,-3-5,连接带平端的两个 DNA 分子,粘性末端,平端,E.co

13、li DNA聚合酶 I Klenow片段Klenow片段是 E.coli DNA 聚合酶 I 的羧基端片段，长度为全酶的 70。具有 5 3 聚合酶活性及 3 5 外切酶活性。,蛋白酶酶切位点 Klenow 片段,5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 EcoRI5 G 3 5 AATTC 33 CTTAA 5 3 G 5 Klenow,dNTPs5 GAATT 3 5 AATTC 33 CTTAA 5 3 TTAAG 5,5 3 聚合酶活性：补平限制性内切酶酶切所产生的 3 凹端而形成平端,5 GGTACC 3 3 CCATGG 5 KpnI5 GGTAC 3 5 C 33 C 5 3

14、CATGG 5 Klenow5 G 3 5 C 33 C 5 3 G 5,3 5 外切酶活性：去除限制性内切酶酶切所产生的3凸端而形成平端,逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)逆转录酶为依赖 RNA的 DNA聚合酶，具有 5 3 聚合酶活性外，以 RNA为模板合成 DNA。逆转录酶还具有核糖核酸酶H(RNase H)活性，可 从 5 末端或 3 末端降解RNA:DNA杂合链中的 RNA。依赖 DNA的 DNA聚合酶 逆转录酶无 3 5 外切酶活性。,禽类逆转录酶和鼠类逆转录酶的比较,以 mRNA为模板合成第一条 cDNA链，所用的引物包括 Oligo(dT)12-18特

15、定序列的寡核苷酸 随机序列的寡核苷酸 构建 cDNA 文库：用 Oligo(dT)12-18 引物 克隆特定的 cDNA：用特定序列的寡核苷酸引物 RT-PCR：用特定序列的寡核苷酸引物 制备 cDNA 探针：用特定序列的寡核苷酸引物或 随机序列的寡核苷酸引物,MMLV RT催化的 cDNA合成,proinsulin cDNA的合成,载体和宿主细胞(Vectors and Host cells),载体（vector）是为携带感兴趣的外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子,按功能分,克隆载体（cloning vector）,表达载体（expre

16、ssion vector）,按基本元件的来源不同,质粒载体噬菌体载体黏粒载体病毒载体人工染色体载体等,载体概述,载体(Vectors)克隆载体(Cloning vector)用于构建基因组文库、cDNA文库以及克隆某一特定基因 或 cDNA 以测定其核苷酸序列。使外源DNA被扩增(1)质粒(plasmid)(2)噬菌体载体(phage)(3)粘粒(cosmid)(4)细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)(5)酵母人工染色体(Yeast artificial chromosome,YAC)表达载体(Expression vector)用于表达某

17、一基因或 cDNA以获得目的蛋白质。表达载体 包括原核表达载体和真核表达载体，表达载体的种类较多，可根据要表达的目的蛋白质的特点来选则载体。,克隆载体宿主细胞载体结构外源插入片段质粒大肠杆菌环状质粒0.1-10 kb 噬菌体载体大肠杆菌线状病毒8-25 kb粘粒大肠杆菌环状质粒35-45 kb细菌人工染色体大肠杆菌环状质粒50-300 kb酵母人工染色体酵母线状染色体100-1000 kb,不同类型克隆载体的比较,克隆载体应具备的主要特点,至少有一个复制起点（origin of replication,ori）至少有一个选择性标志（selection marker）有适宜的限制性内切酶的单一切

18、点：称为多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）应有较高的拷贝数。,pBR322质粒图谱,质粒是存在于细菌染色体(基因组)外的 DNA 分子，其 大小在 1 kb-200 kb 范围内。质粒是双链、共价闭合的环状 DNA 分子，以超螺旋形式 存在。质粒具有复制起始点，可在细胞中进行自我复制，并将质 粒 DNA 分配给子细胞。高拷贝数质粒：10-200个/细胞低拷贝数质粒：几个/细胞 质粒还含有在特定环境条件下所必需的基因，如抗生素的 抗性基因。,质粒(plasmid),克隆质粒(Cloning plasmid)低分子量 易于提取且不易断裂高拷贝数 可大量扩增被克隆的目

19、的基因、DNA 片段或 cDNA。(3)含有一个或几个可供选择的标记，抗生素抗性基因、细菌 lacZ 基因片段及 ccdB 致死基因等。(4)含多克隆位点 质粒基因内有多个限制性内切酶单一识别位点，并允许外源 DNA 插入。,质粒载体所携带的复制子,基因组 DNA,质粒 DNA,细菌基因组 DNA 和质粒 DNA,超螺旋质粒 DNA,闭环质粒 DNA,细菌,抗生素的作用位点,C,C,O,NH,C,C,C,N,O,S,H,CH3,H,CH3,HOOC,H2N,H,氨苄青霉素,-内酰胺环,-内酰胺酶作用位点,抗生素的抗性基因产物及其功能,ApR:Ampicillin resistance gene

20、rep(ori):replication originlacZ:N-terminal-galactosidaseMCS:multiple cloning sites,MCS(pUC18),克隆质粒带有E.coli 乳糖操纵子的 lac 启动子及编码-半乳糖苷酶氨基端(-供体片段，146 氨基酸)的 DNA 片段。E.coli 宿主细胞(DH5,JM109,XL1-Blue 菌株)的乳糖 操纵子的-半乳糖苷酶基为缺陷型，只能编码-半乳糖 苷酶的羧基端片段(-受体片段)。异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导质粒上的-供体 片段和宿主细胞的-受体片段的表达，两者结合后才有-半乳糖苷酶活性，使底物

21、5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖 苷(X-gal)产生蓝色。两个无活性片段组合而成为功能完整的-半乳糖苷酶的过程称为-互补。,-互补(-complementation),lacI,P,lacO,CRP site,MCS,lacZ”,P,lacO,CRP site,质粒,lacZ,宿主细胞基因组,无外源 DNA 片段 插入 MCS,-半乳糖苷酶氨基端(-供体片段),IPTG 诱导,-半乳糖苷酶羧基端(-受体片段),水解 X-gal(蓝色菌落),-互补,lacI,IPTG 诱导,-供体片段,-受体片段,-半乳糖苷酶活性,X-gal,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,转 化,-

22、半乳糖苷酶氨基端,-半乳糖苷酶氨基端,-半乳糖苷酶羧基端,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷酶水解 X-gal，菌落呈蓝色,lacI,P,lacO,CRP site,外源 DNA 片段,外源 DNA 片段破坏 lacZ,外源 DNA 片段 插入 MCS,质粒,宿主细胞基因组,lacZ”,P,lacO,CRP site,-半乳糖苷酶羧基端,lacI,IPTG 诱导,IPTG 诱导,无-半乳糖苷酶氨基端产生,无-半乳糖苷酶活性,不水解 X-gal(白色菌落),.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,外源 DNA 片段破坏 lacZ,转 化,无-半乳糖苷酶氨基端,-半乳糖苷酶羧基端,无-半乳糖苷酶活性

23、,不水解 X-gal，菌落呈白色,噬菌体,由 噬菌体改造而成的载体，可容纳 5-25 kb的外源 DNA 片段，常用于构建基因组文库或 cDNA 文库。(1)插入型载体 只有一个目标位点可供外源 DNA 插入的载体为插入型载体。可在克隆位点插入 5-11 kb 的外源 DNA 片段。(2)置换型载体 在非必需 DNA 两侧有一对克隆位点的噬菌体载体称作置换型载体。中部的 DNA 由外源 DNA 片段(8-25 kb)所置换。,噬菌体载体(Phage vector),外源 DNA,重组 DNA 分子,体外包装,携带重组 DNA 分子的 噬菌体,DNA 连接酶,限制性内切酶,(1)粘粒载体是质粒和

24、 噬菌体的重组体，将含有 cos 位 点的部分 DNA 插入到质粒中即构建成粘粒载体。(2)粘粒载体可容纳 35-45 kb 的外源 DNA 片段，用于构 建基因组 DNA 文库。(3)粘粒载体可经体外包装而形成感染颗粒，然后转导入 大肠杆菌，具有较高的转导率。,粘粒(Cosmid),(1)BAC是环状 DNA 分子，包括 MCS 抗生素抗性基因、复制子：来源于大肠杆菌 F 因子 RepE：调节复制复合物在复制位点处组装 parA-C 基因：确保子细胞含有单拷贝质粒 cos 位点：用于噬菌体外壳蛋白包装(2)BAC 可容纳至 1 Mb 大小的外源 DNA 片段。用电穿孔 方法将 BAC 与外源

25、 DNA 片段的连接物导入大肠杆菌 或经噬菌体外壳蛋白包装后转导大肠杆菌。,细菌人工染色体(Bacterial artificial chromsome，BAC),目的基因的表达(Expression of target genes),功能分析,结构分析,建立药筛模型,临床药物,获得目的基因或 cDNA,亚克隆到表达载体,表达目的蛋白,基因治疗,表达载体(Expression vectors)用于表达某一基因或 cDNA以获得目的蛋白质 表达载体包括原核表达载体和真核表达载体 根据要表达的目的蛋白质的特点来选择载体,复制起始点(Replication origin)多克隆位点(Multiple

26、 cloning sites)抗生素抗性基因(Antibiotics resistance gene)启动子(promoter)转录终止子(transcription terminator)加 PolyA 的信号序列(真核表达载体)核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS),表达载体,启动子,转录终止子,抗生素抗性基因,多克隆位点,复制起点,表达载体,（一）原核表达载体 除具备克隆载体的一般特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。原核表达载体 大肠杆菌表达载体 基本组成如下：,R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；

27、TT：转录终止序列,大肠杆菌表达载体,Lac启动子（乳糖启动子）Trp启动子（色氨酸启动子）Tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子）PL和PR启动子（噬菌体的左向和右向启动子）T7启动子,启动子 表达必需元件，其能被RNA聚合酶所识别：目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种,2.SD序列提供核糖体结合位点 mRNA在细菌中的翻译严格依赖于核糖体结合位点（ribosome binding site）的存在。SD序列作为核糖体结合位点，保证了翻译起始复合物的形成。,3.转录终止序列有助于外源基因的高效表达 多数原核表达载体中都带有转录终止序列 转录终止序列长短不一，几十bp-几百bp 有助于使R

28、NA聚合酶重点转录克隆的外源基因,4.几种常见的原核表达载体各有特点 依据表达目的蛋白的方式，可将原核表达载体分为（1）非融合型表达载体（2）融合型表达载体（3）分泌型表达载体,（1）非融合型表达载体用于表达非融合蛋白 非融合蛋白是指不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起进行表达的蛋白。表达该类蛋白的载体称为非融合型表达载体。,强启动子tac多克隆位点目的基因克隆于启动子和SD序列下游rrnB核糖体RNA转录终止子，稳定载体系统，不至于干扰与载体本身稳定性有关的基因表达。载体的其余部分来自pBR322。使用pKK223-3时，应配套使用LacIq宿主菌，在无IPTG诱导时，tac启动子受阻遏，当加

29、入IPTG后，便可去阻遏，从而使外源基因表达。,将一段特殊蛋白质基因构建入载体，使之与目的蛋白融合表达形成融合蛋白（fusion protein）。表达该类蛋白的载体称为融合型表达载体，如pGEX系统（pGEX-lT、pGEX-2T、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P）。载体使用强启动子tac，SD序列下游GST基因多克隆位点用IPTG可诱导目的基因表达，表达产物与GST融合，故可利用该标签对蛋白进行纯化。,（2）融合型表达载体用于表达融合蛋白,把受体细菌内表达的外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。启动子、编码信号肽的序列（通常置于SD序列下游

30、）。非融合蛋白、融合蛋白表达。pIN 系列载体 常用，可使所表达的蛋白分泌到宿主菌的周质腔中。,（3）分泌型表达载体用于外源基因的分泌表达,pIN 系列载体有3种，即pIN-ompA1、pIN-ompA2和pIN-ompA3，分别适用于使用不同密码子框架的目的基因的插入，克隆位点分别为EcoR、Hind和BamH。,T7 启动子：与 T7 RNA 聚合酶特异结合 RBS：目的蛋白质翻译时 mRNA 与核糖体结合的位点 标记：便于检测和纯化目的蛋白(1)组氨酸标记(His-Tag)6-10个组氨酸与目的蛋白质的 N 或 C 末端形成融合蛋 白，便于用组氨酸-Ni2+亲和层析方法一次纯化目的蛋 白

31、质。His-tag 是亲水性物质，不影响目的蛋白的三维 空间构象的形成，因此，His-tag 不影响目的蛋白质的 生物活性。(2)其它标记 T7-Tag，S-Tag，GST-Tag，CBD-Tag 等 T7 转录中止子,原核表达载体-pET 表达系统,（二）真核表达载体用于在真原核细胞中表达外源基因,真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。,真核表达载体中还具有：真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、poly A 加尾信号等 真核细胞复制起始序列 真核细胞药物抗性基因,OriPro：原核复制起始序列P：启动子MCS：多克隆位点TT：转录终止

32、序列orieuk：真核复制起始序列注：不是所有真核表达载体都有整合序列,真核表达载体的基本组成,酵母表达载体昆虫表达载体哺乳类细胞表达载体,根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可主要分为：,用于基因治疗的病毒表达载体 逆转录病毒载体(Retroviral vectors)腺病毒载体(Adenoviral vectors)用于转基因动物的表达载体 含组织表达特异性的启动子,其它特殊表达载体,脂质双层,受体结合蛋白,逆转录酶,病毒 RNA 基因组(2 个分子拷贝),核心蛋白质,病毒 RNA 基因组,逆转录病毒(Retrovirus),逆转录病毒生活周期,逆转录病毒载体的构建,(/),转染,包装细胞

33、系,目的基因,逆转录酶和整合酶,目的基因和选择性标记以及调节序列的RNA,感染靶细胞,目的基因和选择性标记以及调节序列的RNA被包装成“病毒”颗粒,靶细胞,目的基因整合到靶细胞的基因组DNA中,宿主细胞的选择由所用的载体来决定，即细胞必须与载体匹配。大肠杆菌 BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE 等 酵母细胞 P.pastoris，S.Cerevisiae，S.pombe 和 P.methanolica 昆虫细胞系 S2，Sf9，Sf21 各种高等真核生物组织细胞,表达用宿主细胞,大肠杆菌：化学法和电穿孔法转化 酵母细胞：电穿孔法转化 昆虫细胞和哺乳类

34、细胞：转染和感染(1)转染 CaPO4/DNA共沉淀法 DEAE-葡聚糖方法 脂质体法 电穿孔法 显微注射法(2)感染 用携带目的基因的“病毒”颗粒感染宿主细胞,表达载体导入宿主细胞的方法,CaPO4-DNA共沉淀法 钙离子与 DNA的磷酸基团结合形成不溶沉淀 CaPO4-DNA，并附着于细胞表面，通过细胞内吞作用被细胞所吸收。DEAE-葡聚糖方法 带正电荷的 DEAE-葡聚糖与带负电荷的 DNA 磷酸基团结合形成 DEAE-葡聚糖-DNA 复合物并结合带负电荷的细胞膜，通过细胞内吞作用被细胞所吸收。脂质体法 阳离子脂质富集 DNA 分子，形成稳定的 DNA-脂质体并附着于带负电荷的细胞膜，脂

35、质体与细胞膜发生融合，DNA 被细胞所吸收。电穿孔法 原理同电穿孔转化方法，但所用的参数不同。,转染方法,人工合成的阳离子脂质的结构,构建携带目的基因的表达载体,表达载体被细胞吸收到细胞质中,表达载体转移到细胞核中,目的基因及选择性标记整合到基因组DNA中,目的基因在真核细胞中的表达,暂态表达,稳定表达,转染,暂态表达(Transient expression)携带目的基因的表达载体转染动物细胞后，表达载体以附加体(episome)形式存在于细胞核，目的基因不整合到宿主细胞的基因组 DNA中。通常目的基因的表达及其对细胞的影响在 24-72 小时内被检测到并随着附加体的消失而最终消失。稳定表达

36、(Stable expression)携带目的基因的表达载体转染动物细胞后，经选择培养基的筛选而获得稳定的转染细胞系，目的基因整合到细胞的基因组 DNA中并随着基因组 DNA 的复制而复制。稳定细胞系可以持续表达目的基因。,核糖体,细胞核,RNA,目的蛋白,染色体,1,2,目的基因,选择性标记,1,暂态表达,2,稳定表达,整合,宿主细胞的选择由所用的载体来决定，即细胞必须与载体匹配。1.克隆用宿主细胞(1)基因组修饰的大肠杆菌菌株，如 DH5,NovaBlue,JM109,XL1-Blue 等(2)酵母细胞 Saccharomyces cerevisiae2.表达用宿主细胞(1)大肠杆菌菌株，

37、如 BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS 等(2)酵母细胞(3)昆虫细胞系(4)各种高等真核生物组织细胞,宿主细胞(Host cells),转化(Transformation)：将外源 DNA 导入细菌的过程。转染(Transfection)：将外源 DNA 导入真核细胞的过程。转导(Transduction)：利用噬菌体将外源 DNA 导入细菌 的过程。感染(Infection)：利用病毒将外源 DNA 导入真核细胞的 过程。,载体导入宿主细胞的方法,感受态细胞(Competent cells)是有利于外源 DNA分子进入的细胞。所用的转化方法不同，处理细胞使其进入感受态的方法也

38、不同。化学转化(Chemical transformation)用 30 mM-100 mM 的 CaCl2 处理大肠杆菌，细胞周围的 CaCl2 促进 DNA 结合到细胞表面并增加细胞对 DNA 的 通透性。转化率为 5 X 106-2 X 107 转化子/g DNA。物理转化(Physical transformation)电穿孔法(Electroporation):当细胞经受高压电流脉冲 时，细胞膜上可逆地形成小至 2 n m大小的孔洞，介质中 的 DNA 分子很容易通过孔洞进入细胞质。转化率为 109 转化子/g DNA。,转化方法,DNA克隆的基本过程Procedure of DNA

39、 Cloning,目的DNA的分离获取（分）载体的选择与准备（择、切）目的DNA与载体连接（接）重组DNA转入受体细胞（转）重组体的筛选与鉴定（筛）,DNA克隆的基本过程,风格法,如何获得目的基因(1)基因组文库中获得(2)cDNA文库中获得(3)通过PCR技术获得(4)人 工 合 成,一、化学合成法可直接合成目的DNA,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列应用：一般用于小分子肽类基因的合成,*化学合成法获取目的DNA,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,色 苯丙 蛋 赖,第一步：构建基因组DNA文库（是指包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克隆群体，以DNA片段

40、的形式贮存了所有的基因组DNA信息）。第二步：筛选含有目的基因的克隆。,二、从基因组DNA文库中获取目的DNA,组织或细胞染色体DNA,基因片段,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶或机械剪切,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合,*从基因组DNA文库获取目的基因,三、从cDNA文库中获取目的DNA 第一步：构建cDNA文库（包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存了全部的基因表达信息）。第二步：筛选含有目的cDNA的克隆。,cDNA文库存在于转化细胞

41、内由克隆载体所携带的所有cDNA片段的集合,基因组DNA文库和cDNA文库的构建,从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选目的DNA的策略1.菌落或噬斑原位杂交2.针对表达文库，可用抗原-抗体或配体-受体结合的原理（亲和筛选法）筛选,*从基因组DNA文库获取目的基因,菌落原位杂交法等方法，可从文库中筛选含有目的基因的噬菌体,cDNA library,从cDNA文库获取目的基因,如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文库构建过程。PCR是一种高效快速的体外DNA聚合程序,四、经PCR获取目的DNA,PCR 体系,模板引

42、物耐热DNA聚合酶dNTPs含Mg2+的缓冲液,PCR的过程,变性(Denaturing):经加热使模板DNA 从 dsDNA 变成ssDNA退火(Annealing):引物与模板DNA杂交延伸(Extension):DNA 合成,ing,PCR的头三个循环,基因组 DNA 的制备(Preparation of genomic DNA),从细胞或组织中提取的基因组 DNA 可用于:建立基因组文库；克隆特定的基因；用 Southern 印迹检测某一基因的存在和拷贝数；用 PCR 反应检测基因的存在和突变等；进行 RFLP(限制性片段长度多态性)分析,蛋白酶 K 和 SDS 可破坏细胞膜及细胞中的

43、蛋白质，使 基因组 DNA 从破碎的细胞中释放出来。酚/氯仿去除核酸溶液中的蛋白质以纯化 DNA。盐离子存在时乙醇或异丙醇沉淀基因组 DNA以浓缩 DNA。从 1 g 哺乳动物组织或 109 培养细胞中可得到 2 mg 基因组 DNA。从细菌或真菌中制备基因组 DNA 时，首先用溶菌酶破坏其细胞壁结构。,基因组DNA的制备原理,(1)细胞裂解 在 50C条件下用裂解缓冲液(100 mM NaCl；10 mMTris-Cl,pH 8.0；25 mM EDTA,pH 8.0；0.5%SDS；0.1 mg/ml 蛋白酶 K；100 g/ml RNase A)消化组织细胞 16-18小时；消化培养细胞

44、 2-3 小时。(2)蛋白质淬取 用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)淬取蛋白质。(3)基因组 DNA 沉淀 用 0.1 倍体积的 3 M NaAC 和 2.5 倍体积的 100%乙醇沉淀 DNA,用 70%乙醇除去 DNA 沉淀中的盐离子。(4)将基因组 DNA 溶解在 TE 缓冲液中，使其终浓度为 1 mg/ml，置 4C 保存。,基因组DNA的制备方法,(1)防止内源性 DNase 应快速分离、剪切、匀降组织或快速洗涤培养细胞。一旦组织 被冷冻或培养细胞被加到裂解缓冲液中，DNA 将免于被 DNase 降解。尽量将组织切得小一些，便于蛋白酶 K 和 SDS 快速、有 效的作用于组织块。(

45、2)保证得到高分子量的基因组 DNA，以便于构建基因组文库。因 此，在制备基因组 DNA 过程中应减少物理机械作用，如不要使 用旋涡振荡仪等。(3)保证基因组 DNA 不被蛋白质所污染，否则将影响限制性内切酶 对 DNA 的酶切作用。高纯度 DNA 的 OD260/OD 280 值大于 1.8；50%蛋白质/50%DNA 混合物的 OD260/OD280 值大约为 1.5。,制备基因组DNA时的注意事项,小鼠基因组 DNA1.未被酶切的 DNA2.HindIII 酶切产物3.MboI 酶切产物,1 2 3,基因组DNA的检测,总 RNA 的制备(Preparation of total RNA

46、),从组织或细胞中提取总 RNA 的目的是:纯化 mRNA；建立 cDNA文库；克隆特定的 cDNA；用 Northern 印迹方法检测某一特定基因的表达；用 RT-PCR 方法检测某一特定基因的表达。,异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠为强烈的蛋白质变 性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，使 总 RNA 从细胞中释放出来。异硫氰酸胍和-巯基乙醇等还原剂使内源性 RNA 酶(RNase)变性失活,防止 RNA 被降解。,异硫氰酸胍法提取总 RNA,焦碳二乙酯(DEPC)使外源性 RNase 变性并失活。用 0.1%DEPC 处理 ddH2O 16-20 小时，再用 DEPC-ddH2O 配制缓

47、冲液，然后高压灭菌除去 DEPC。用 0.1%DEPC 浸泡 EP 管、Tip 头 16-20 小时，然 后高压灭菌除去 DEPC。置玻璃匀浆器、量筒和烧杯等于 180C 烤箱中烘烤 小时。,提取 RNA 时所用缓冲液及器皿的处理,用 TRIzol 试剂(Invitrogen/GIBCO 公司)提取总 RNA的方法;TRIzol 试剂的主要成分为异硫氰酸胍、-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠。,用 TRIzol 试剂处理细胞或匀浆组织氯仿萃取蛋白质沉淀 RNA洗涤 RNA 沉淀用 RNase-free ddH2O 溶解 RNA，并置-20C保存检测 RNA(加l RNA到%琼脂糖凝胶中),总RNA提

48、取过程,rRNA 80%哺乳动物细胞的总 RNA tRNA 和 snRNA 10%mRNA 1-3%,MRNA分子量标准(RNA ladder)1,2人肝细胞总 RNA 28S rRNA(5025 bp)18S rRNA(1868 bp)28S rRNA 条带强度是18S rRNA 条带强度的 2 倍。,RNA 的检测,质粒 DNA的制备(Preparation of plasmid DNA),用 SDS 和 NaOH 裂解细菌，使质粒 DNA 从细胞中释放出来。NaOH 使细菌的染色体 DNA 及质粒 DNA 变性。用 KAc 中和 NaOH，质粒 DNA 迅速复性并恢复天然的超螺旋结构;高

49、分子量的染色体 DNA 难于复性而与细胞碎片一起沉淀下来，而质粒 DNA 存在于上清中。注：当大量质粒制备时，需先使用溶菌酶水解细胞壁。溶菌酶催化细菌细胞壁肽聚糖中 N-乙酰葡糖胺与 N-乙酰胞壁酸残基之间-1，4 连接的水解。,碱裂解法原理,酚和氯仿去除核酸溶液中的蛋白质以纯化 DNA。Tris-HCl 饱和酚：用 Tris-HCl(pH 8.0)来饱和酚,使 其 pH 值达到 8.0；否则呈酸性的酚将导致 DNA 分子 损伤断裂。酚：氯仿：异戊醇 25：24：1 酚：氯仿 1：1 乙醇或异丙醇沉淀 DNA DNA 溶液中的盐离子中和 DNA分子上的磷酸根，导致 DNA 分子在乙醇或异丙醇中

50、沉淀出来，达到浓缩 DNA 的目的。2.5 倍体积的乙醇 1 倍体积的异丙醇,DNA 的纯化与浓缩,常用的盐溶液,盐类储存液(M)终浓度(M)醋酸钠3.00.3氯化锂8.00.8氯化钠5.00.2,注：需用 70 乙醇洗涤 DNA 沉淀以除去 DNA 中 的盐离子。,质粒 DNA 的制备过程,大肠杆菌的生长质粒的提取质粒的鉴定,生长滞后期 适应期，细菌生长缓慢 对数期 在丰富的培养基中，大肠杆菌在 20-30 分钟内复制 一代。饱和期(平台期)培养基中的营养成分和氧耗尽，培养基中的细菌代谢 产物达到抑制细菌快速生长的浓度；细菌密度为 1 X 109-2 X 109 细胞/ml LB 培养基,大