哺乳动物基因工程.ppt

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1、四、高等哺乳动物的基因转移,第十六章 哺乳动物基因工程,三、高等哺乳动物的载体系统,二、高等哺乳动物的受体系统,一、高等哺乳动物基因工程的基本概念,五、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白,一、高等哺乳动物基因工程的基本概念,第六节 哺乳动物基因工程,高等哺乳动物基因工程,高等哺乳动物细胞基因表达技术,高等哺乳动物转基因技术,转基因动物个体,动物工程细胞,哺乳动物遗传性状改良,药物筛选研究评价模型,人体基因治疗,蛋白多肽物质大规模生产,药物筛选研究评价模型,二、高等哺乳动物的受体系统,1、高等哺乳动物细胞的生长特性2、高等哺乳动物受体细胞的条件3、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记4、常用的高等哺乳动

2、物受体细胞,第十六章 哺乳动物基因工程,1、高等哺乳动物细胞的生长特性,正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：,锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂,血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长,接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制,形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构,上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代,且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞,会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状,态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。,2、高等哺乳动物受体细胞的条件,以高效表达外源基因为目标的高等

3、哺乳动物受体细胞应具备下列条件,细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大 规模培养,遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存,合适的标记 便于转化株的筛选和维持,生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制,大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能,安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌,满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。,3、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,营养缺陷型的哺乳动物受体细胞,5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）,次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）,次黄嘌呤核苷（HR）,GMP,AMP,尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）,胸腺嘧啶核苷一磷酸（

4、TMP）,胸腺嘧啶核苷（TR）,嘌呤核苷酸生物合成途径,嘧啶核苷酸生物合成途径,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶,（HPRT）,（TK）,胸腺嘧啶核苷激酶,氨基喋呤（AP）,氨基喋呤（AP）,从头合成途径,补救合成途径,3、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,营养缺陷型的哺乳动物受体细胞,含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，

5、载体上的标记基因hprt与之遗传互补,3、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记,遗传标记,编码产物,筛选药物,作用机理,APH-氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418,DHFR 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤,HPH-潮霉素B磷酸转移酶 潮霉素B HPH灭活潮霉素B,TK-胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMP,XGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMP,ADA-腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A,4、常用的高等哺乳动物受体细胞,迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产,

6、的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优,势有如下几个方面：,遗传背景清楚，生理代谢稳定,与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确,基因转移和载体表达系统完善,耐受剪切力，便于大规模培养,被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）,三、高等哺乳动物的载体系统,1、人腺病毒DNA,2、猴空泡病毒DNA（SV40）,3、人乳多瘤病毒DNA（BKV）,4、人牛痘病毒DNA,第十六章 哺乳动物基因工程,1、人腺病毒DNA,腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个,成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒,腺病毒的生物学特性,有6个亚属

7、，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型,（Ad5）病毒。,腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，,绝大多数的腺病毒成员均能致癌。,腺病毒的基因组DNA,ITR,ITR,E1,E2,E3,E4,IVa2,VA,L1,L2,L3,L4,L5,腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%，DNA两端各有,一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的,表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子，L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期,基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗

8、粒,的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段，,使得载体的装载量提高到4 kb以上。,1、人腺病毒DNA,基因重排低 外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期,腺病毒DNA载体的特点,安全性能好 不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤,宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格,使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达,1、人腺病毒DNA,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、,VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNA,a.SV40的生物学特性,SV40可以

9、与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从,而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。,SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，,便发生非同源整合而致癌。,b.SV40的基因组DNA,t/T基因编码病毒的小抗原和大,抗原与病毒的致癌作用密切相关,SV40在裂解宿主细胞前的晚期,状态时，每个宿主细胞含有105个病,毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效,表达外源蛋白,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,c.SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建,重组的SV40 DNA分子必须经过,包装后才具有感染能力，因此插入的,外源DNA片段不

10、能太大。为了尽量提,高SV40的装载量，必须删除一些基因,片段，因此重组的SV40分子必须与野,生型病毒共感染受体细胞，才能形成,有感染力的重组病毒颗粒。,Apr,ori,viral gene,gpt,SV40 ori,pV2-GPT,pBR322,pBR322,SV40,pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其,中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该,载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.,d.利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序,SV40 载体,病毒晚期基因启动子,筛选标记,ori,缺陷的SV40 辅助病毒

11、,去除细菌序列,插入外源基因,重组分子,分离病毒DNA,转化,筛选,增殖,感染,3、猴多瘤病毒DNA（SV40）,基因表达好 外源基因能高效表达,SV40 DNA载体的特点,基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象,宿主范围窄 只能转染猴细胞,装载量较小,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,3、人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因,组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自,a.人乳多瘤病毒的生物学特性,主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝,3、人乳多瘤病毒DNA（BKV）,b.人乳多瘤病毒表达载体的构建,B

12、KV-E.coli 穿梭载体,BKV ori,BKV gene,DRE,MMTP,Ap r,E.coli ori,SV40 P,Neo r,删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的,基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成,穿梭载体，它不能整合，同时也不能,形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。,安装细胞色素P450 dioxin介导的增强,子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达。,SV40来源的启动子控制Neor 标记基因，以G418筛选重组子。,以此载体在人细胞系中表达b1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功。,4、人牛痘病毒DNA,人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185 kb，

13、能在宿主细,胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建,a.人牛痘病毒的生物学特性,出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的,病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外,DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。,4、人牛痘病毒DNA,目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒,其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在,b.人牛痘病毒DNA表达载体的构建,外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大,量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重,组质粒导入

14、哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体,DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。,人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。,4、人牛痘病毒DNA,c.利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序,牛痘病毒启动子,T7 RNA聚合酶基因,T7启动子,外源基因,细菌重组质粒,感染,转化,培养,收集,四、高等哺乳动物的基因转移,（一）哺乳动物细胞的物理转化法,（二）哺乳动物细胞的病毒转染法,（一）哺乳动物细胞的物理转化法,利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达,盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻,了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后

15、，往往以多拷贝的形式随,机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。,（一）哺乳动物细胞的物理转化法,将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此,时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；,此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受,体细胞；,1.磷酸钙共沉淀法,将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37保温4-16小时,弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。,如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化,效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为,癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早

16、理解。,（一）哺乳动物细胞的物理转化法,将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的,样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时,电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在,悬浮液中的淋巴细胞等。,2.电击转化法,DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。,（一）哺乳动物细胞的物理转化法,将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面,活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。,合，DNA随即进入胞质和核内。,利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa,3.脂质体介导法,将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便

17、会与受体细胞膜融,细胞。,（一）哺乳动物细胞的物理转化法,通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌,鼠，从其输卵管内取出受精卵；,性原核内。,上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操,4.显微注射法,借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄,作，所以不太适用于基因的克隆和表达。,（一）哺乳动物细胞的物理转化法,血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环,境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞,同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可,恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转入血影细胞，

18、然后再将,5.血影细胞介导法,核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的,血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受,体细胞。,（二）哺乳动物细胞的病毒转染法,以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒,共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导,入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围,有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。,五、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白,1.哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,2.利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体,3.利用哺乳动物工程细胞生产人

19、组织型纤溶酶原激活剂,4.利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊,方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶,数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩,增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶,通过强化基因扩增高效表达外源基因,（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多,的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区,哺乳动物细胞内的基因扩增现象,域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的

20、DNA区域同时被扩增。,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,通过强化基因扩增高效表达外源基因,DHFR-MTX高效表达系统,外源基因,dhfr,转染dhfr-细胞系,单克隆,培养,转移,0.05 mM MTX,培养,单克隆,转移,培养,单克隆,转移,5 mM MTX,0.25 mM MTX,培养,单克隆,外源基因扩增至100拷贝,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,通过强化基因扩增高效表达外源基因,GS-MSX高效表达系统,谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细,胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细,中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常

21、的MSX浓度下就能筛,选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-,胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程,MTX系统优越之处。,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,通过强化基因转录高效表达外源基因,在载体上安装病毒或细胞来源的强启,mRNA前体,AAAAAAAAA,mRNA,动子以及有效的翻译元件，也是使外源基,因高效表达的一种手段，如：,细胞巨化病毒CMV的启动子,动物珠蛋白基因的内含子,SV40的终止子和polyA化信号序列,绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体,上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪,切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利,

22、于翻译。有的还含有各种信号肽序列。,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白,迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但,在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：,b 干扰素g 干扰素,凝血因子VIII凝血因子IX,促红细胞生成素（EPO）生长因子（hGH）,白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原,单克隆抗体 CD4受体,组织型纤溶酶原激活剂（tPA）,利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体,大多数恶性淋巴,Neor,鼠金属硫蛋白启动子,b 肌动蛋白启动子,抗体轻链cDNA,b 肌动蛋白终止子,pL,dhfr,SV40启动子,b 肌动蛋

23、白启动子,抗体重链cDNA,b 肌动蛋白终止子,pH,瘤细胞表面上都,有一种特异性的,糖蛋白campath,用人源化的小鼠,抗campath抗体,治疗非霍金淋巴,细胞瘤患者，效,果良好。重组抗,体采用DHFR-M,TX系统表达。,利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂,第一个由重组哺乳动物,dhfr,启动子,人tPA cDNA,终止子,细胞规模化生产的医用蛋白,是治疗急性心肌梗塞的溶血,栓药物：人组织纤溶酶原激,活剂（tPA）。同样采用,DHFR-MTX系统表达，受体,细胞选用CHO系统。目前，,用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化。,信号肽编码序列,此外，人tPA也可由重组大肠杆菌

24、生产，但蛋白的重折叠效率低。,利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII,凝血因子VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病,病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子VIII生物制品进行治疗，然,而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制,品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。,早在上述情况发生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鉴,定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA,相似，人凝血因子VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳,动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIII尚不能满足几代,血友病人的大量需求。,