发酵工程知识讲座PPT.ppt

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1、发酵工程,发酵与我们的生活,发酵与我们的生活,维生素,氨基酸,干扰素,疫 苗,青霉素,发酵与我们的生活,生 物 菌 肥,生 物 杀 虫 剂,主要内容,发酵工程概论 一、发酵及发酵工程的概念 二、发酵工程的发展简史发酵工程特点及其类型 一、发酵的特点 二、发酵的生产类型发酵方法的分类及流程发酵过程工艺控制 一、提供优良的菌种 二、掌握好移种时机和接种量,主讲内容,三、发酵过程中的代谢变化及控制 四、基质浓度变化及控制 五、温度对发酵的影响及控制 六、溶解氧对发酵的影响及控制 七、pH对发酵的影响及其控制 八、CO2对发酵的影响及其控制 九、泡沫对发酵的影响及其控制 十、发酵终点的判断及异常发酵情

2、况的处理,发酵工程概论,早期的发酵概念微生物在无氧条件下的代谢过程。英文的发酵，fermentation一词来源于拉丁语的“发泡”，fervere。发酵概念的发展利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或代谢产物的过程统称为发酵。,一、发酵及发酵工程的概念,发酵工程概论,发酵工程概念：是指采用工程技术手段，利用生物（主要是微生物）和有活性的离体酶的某些功能，为人类生产有用的生物产品，或直接用微生物参与控制某些工业生产过程的一种技术。从广义上讲，由上游工程、中游过程（发酵工程）、下游过程三部分组成。,发酵工程概论,上游工程,下游工程,优良菌株的选育保藏、发酵条件的确定（pH、温度、

3、溶氧和营养）等,产品分离纯化（固液分离、细胞破壁、蛋白质纯化）、喷雾干燥、产品检验、包装处理等,强调过程优化与控制,发酵过程,发酵工程概论,发 酵 工 程,传统发酵工程,现代发酵工程,利用微生物的生长和代谢活动来大量生产人们所需产品的过程理论与工程技术体系。该技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与分离纯化制备等技术集成。,是将DNA重组及细胞融合技术、酶工程技术、组学及代谢网络调控技术、过程工程优化与放大技术等新技术与传统发酵工程融合，大大提高传统发酵技术水平，拓展传统发酵应用领域和产品范围的一种现代工业生物技术体系（新一代工业生物技术）。,强调现代生物技术、控制技

4、术和装备技术在传统与现代发酵工业领域的集成应用。,发酵工程概论,抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等,基因工程药物、细胞工程药物、疫苗；替代石油工业的大宗量的生物基化学品等，以及传统发酵工业升级。,传统生物发酵,现代生物发酵,1900以前 天然发酵阶段19001940 纯培养技术的建立（巴斯德等，人为控制）19401950 通气搅拌纯培养发酵技术的建立（青霉素液体深层培养）19501960 诱变技术与代谢控制发酵技术的建立（赖氨酸发酵生产）19601970 开拓发酵原料时期（石油发酵时期）1970年以后 进入基因工程菌发酵时期，以及细胞 大规模

5、培养技术的全面发展。近年来，以现代生物技术和过程工程技术为基础的 现代发酵工业突飞猛进。,二、发酵工程的发展简史,发酵工程特点及其类型,1.多个反应过程可在发酵过程中一次完成；2.反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备很简单；3.原料来源广泛，可再生；4.可特异性地进行复杂的化学反应；5.要求无菌操作。,一、发酵的特点,二、发酵生产类型,1、以微生物细胞为产物的发酵2、以微生物代谢产物为产品的发酵3、以微生物酶为产品的发酵4、生物转化或修饰化合物的发酵5、微生物废水处理和其他,1、生产微生物细胞物质,定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业（酵母、藻类、单细胞

6、蛋白、药用真菌、生物杀虫剂等）。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。,2、微生物代谢产物发酵,包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物，如氨基酸、核酸、蛋白质等各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物，如抗生素。,从初生代谢到次生代谢,3、微生物酶发酵,产酶的特点：产酶的微生物种类多，易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。分类：胞内酶 和胞外酶生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控

7、作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。,4、微生物的转化发酵,微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成更有经济价值的产物。如维生素C。,5、微生物特殊机能的利用,利用微生物消除环境污染利用微生物发酵保持生态平衡微生物湿法冶金利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。,发酵方法的分类及流程,一、分类：根据对氧的需要区分：厌氧发酵、有氧发酵和兼性厌氧发酵 根据培养基物理性状区分：液体和固体发酵 根据从微生物生长特性区分：分批发酵、补料分批发酵和连续发酵 根据培养方式区分：表面发酵和深层发酵,二、典型分批发酵工艺流程图,主 发酵 罐,种子培养,锅炉,空气压缩机

8、,空气过滤器,蒸煮灭菌,pH调节液,培养基原料罐,纯种分离,斜面培养,摇瓶培养,配料罐,菌体分离后处理,发酵过程控制,培养基制备,种 子 罐,液体产品,固体产品,产品精制,发酵过程工艺控制,发酵是一个复杂的生物化学过程影响因素很多：菌种、培养基、温度、pH、溶氧、污染等。主要包括：一、提供优良的菌种 二、掌握好移种时机和接种量 三、发酵过程中的代谢变化及控制 四、基质浓度变化及控制 五、温度对发酵的影响及控制 六、溶解氧对发酵的影响及控制 七、pH对发酵的影响及其控制 八、CO2对发酵的影响及其控制 九、泡沫对发酵的影响及其控制 十、发酵终点的判断及异常发酵情况的处理,发酵过程工艺控制,要想通

9、过发酵工程获得符合人们要求的产品，菌种的优劣是影响发酵水平的先决条件。那么优良的菌种具备哪些特性呢？,一、提供优良的菌种,1、细胞的生活力强，移种至发酵罐后能迅速生长2、不产生或少产生副产物及其他产物3、能广泛利用原材料，并高效地将原料转化为产品的能力4、无杂菌污染；具有抗噬菌体感染的能力5、泡沫少6、遗传特性稳定，生产能力强,二、掌握好移种时机和接种量,依据菌体（丝）形态、菌龄、OD或特定的参数指标综合判断。移种过早：生长缓慢，发酵周期延长；给 于杂菌可乘之机。移种过晚：菌体生长活力减弱，转入新培 养基调整期延长。,接种时间：对数生长期，菌体量还未达最高峰。,接种量：决定于生产菌种在发酵罐中

10、的繁殖速度。一般地，接种量为10%左右。接种量过小，除延长发酵周期外，往往还引起其它不正常情况。接种量过高，会使菌体生长过快，培养液粘度过高，造成供氧不足。,典型生长曲线,不同生长时期对比情况,微生物发酵生产的水平除了取决于生产菌种的性能；同时还需要有最佳的环境条件即发酵工艺加以配合，才能使其生产能力充分表现出来。最佳发酵工艺条件：如营养要求、培养温度、pH条件、对氧的需求等的控制，使生产菌种处于最佳的产物合成条件下。由于微生物发酵经过很多生物化学反应步骤，往往环境条件的微小变化，就会对微生物的生产能力产生明显影响。所以，为了控制整个发酵过程，必须了解微生物在发酵过程中的代谢变化规律，通过检测

11、方法测定各种发酵参数随时间变化的情况，以便能够控制发酵过程，使生产菌种的生产能力得到充分发挥。,三、发酵过程中的代谢变化及规律,与代谢有关的参数：1、物理参数、温度、罐压、搅拌速度、空气流量、表观粘度、发酵液重量,2、化学参数、基质浓度、pH、产物浓度、DNA量、关键酶、溶解氧、排气中的氧含量、排气中的CO2含量,3、生物参数、菌丝形态、菌丝干重或湿重、菌体比生长速率、氧的比消耗速率、糖的比消耗速率、氮的比消耗速率、产物的比生产速率,四、基质浓度变化及控制,（一）、碳源浓度变化及控制碳源物质是发酵过程中菌体生长和产物合成的能量和碳素的来源。在发酵的前期，碳源物质主要用于生长，消耗较快；在发酵后

12、期，碳源物质主要用于产物合成，消耗速度放缓。快速利用的碳源物质：对生长有利，对次级代谢产物的形成有抑制作用。缓慢利用的碳源物质：对延长产物的合成是有利的，尤其是次级代谢产物。,到发酵的中后期，发酵液中的残糖基本耗尽，影响产物的合成。如果采用丰富碳源的培养基，又会产生其它的问题：如培养基浓度过高，影响通气搅拌，过高的碳源浓度也抑制菌体的生长。解决的方法是采取“中间补料”,（二）、氮源浓度变化及控制 氮源物质主要用于菌体中蛋白质、核酸等含氮物质的合成，有些发酵产物中含有氮。发酵前期，氮源物质随菌体浓度的急剧增加而迅速减少；发酵中期，氮源（氨基氮）的下降速度比较缓慢；发酵后期，由于菌体自溶，氨基氮会

13、回升。氮源物质往往抑制次级产物的合成。,快速利用的氮源物质：如氨水、铵盐促进菌体生长。缓慢利用的氮源物质：有利于延长产物的合成期。如果氮源物质投料多，会造成菌体生长快，但菌体衰老也快。解决方法：“中间补料”。,五、温度对发酵的影响及控制,温度是影响有机体生长繁殖最重要的因素之一，因为任何生物化学的酶促反应都是直接与温度变化有关的，最终影响微生物的生长和产物形成。,1、温度对微生物细胞生长的影响2、温度影响生物合成的方向3、温度对产物形成的影响4、温度影响发酵液的物理性质5、温度归根结底是影响酶的活力。,最适温度的选择与发酵温度的控制,选择最适发酵温度应该考虑三个方面：1）微生物生长的最适温度和

14、产物合成的最适温度。2）不同的菌种、菌种不同的生长阶段最适温度都会不同。3）最适发酵温度，与培养基成分和浓度等相关。温度的控制 依靠夹层或蛇管控制。目前许多发酵罐都采用自动化控制，但要常巡查，确保其正常运行。,六、溶解氧对发酵的影响及控制,溶解氧（CL）：溶解于液体（发酵液）中的氧。氧难溶于水，在25，1标准大气压下，氧在水中的溶解度为0.26m mol/L，临界溶解氧浓度（CCr）：满足微生物呼吸的最低限度的溶解氧浓度。一般好气性微生物约为0.0030.05m mol/L之间。最适氧浓度（Cm）：溶氧浓度对产物合成有一个最适范围，CL过高或过低，对合成都不利。,在好氧深层培养中，氧气的供应往

15、往是发酵能否成功的重要限制因素之一。,（一）影响需氧和供氧的因素,影响需氧量的因素1、菌种特性2、菌体浓度3、菌龄4、培养条件5、代谢类型6、培养基成分和浓度,影响供氧量的因素1、搅拌转速2、通气量3、泡沫情况4、微生物生长情况5、设备结构和参数6、发酵液的理化特性,（二）发酵过程中溶氧变化规律,批式发酵无DO控制情况下，溶氧变化规律为“波谷现象”。当处于高位平衡时，表明供氧性能好。高位平衡通常发生在正常情况的前、后期。低位平衡通常发生在正常情况下的对数期。自然“波谷现象”，一般可以自适应调节。补料与“波谷现象”对应：即补料时间、剂量选择与溶氧变化有关。a.不能在波谷时补料，加重缺氧 b.一次

16、补料不能过量，防止菌体停止呼吸、死亡 c.每次补料都会引起一次大的溶氧下降。,（三）溶解氧的应用,（1）发酵异常指标,发酵中污染杂菌，溶解氧发生异常变化。对于好气性杂菌，溶解氧会一反往常在较短时间内跌到零附近，跌零后长时间不回升。对于厌气性杂菌，溶解氧升高。污染噬菌体或其它不明原因引起 发酵液变稀，此时溶解氧迅速上升。操作故障或事故分析,谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶解氧曲线正常发酵溶解氧曲线-异常发酵溶解氧曲线异常发酵光密度曲线,（2）补料控制指标,中间补料是否得当可以从溶解氧的变化看出。发酵过程中出现“发酸”现象，此时溶解氧很快下降。（3）代谢方向控制指标通过溶氧测量可以掌握由好氧转为厌氧培

17、养的关键时机。在酵母以及其他微生物菌体的生产中，溶氧值是控制其代谢方向的最好的指标之一。（4）设备性能、工艺合理性指标,（四）溶解氧的控制,（1）溶解氧控制的一般原则 生长阶段：CL CCr 生产合成阶段：CL Cm 过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用,（2）溶解氧控制作为发酵中间控制的手段之一,控制原理发酵过程中，糖量 CL 糖量 CL 补糖使CL下降，而CL回升的快慢取决于供氧效率。对于一个具体的发酵，存在一个最适氧浓度（Cm）水平，补糖速率应与其相适应。,，加大补糖速率,，减小补糖速率,实现用溶解氧水平控制补料速率,补糖速率控制在正好使生产菌处于所谓“半饥饿状态”，使其仅能维

18、持正常的生长代谢，即把更多的糖用于产物合成。,控制原则,加强搅拌转速；适当的空气流量；减小培养基粘度；提高氧分压；调节微生物呼吸强度的临界值；合适的细胞浓度、碳源种类、pH、温度等。,（3）提高溶氧的方法,七、pH对发酵的影响及其控制,发酵液的pH变化，与发酵的关系极为密切，对菌体的生长繁殖和产物积累的影响极大，因此是一项重点检测的发酵参数。,（一）发酵液中pH变化的基本原理,微生物代谢对pH影响主要在两种情况下发生：酸性或碱性代谢产物的生成或释放；菌体对培养基中生理酸性或碱性物质的利用。,引起发酵液中pH下降的因素（1）C/N比过高，或中间补糖过多，溶氧不足，致使有机酸积累，pH下降；（2）

19、消泡剂加得过多：脂肪酸增加；（3）生理酸性盐的利用；（4）酸性产物形成：如有机酸发酵。引起发酵液中pH上升的因素（1）C/N比过低（N源过多），氨基氮（NH4）释放；（2）中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多；（3）生理碱性盐的利用；（4）碱性产物形成。,（二）发酵过程中pH的变化规律,生长阶段：pH相对于起始pH有上升或下降的趋势 生产阶段：pH趋于稳定，维持在最适于产物合成的范围 自溶阶段：pH又上升,（三）pH值对发酵的影响,pH值直接影响酶活性；pH影响生物合成的途径；pH值影响菌体形态，如壁厚薄、长径比；pH值改变使原生质膜电荷发生改变，影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的排出；p

20、H值影响某些重要营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。,（四）影响pH变化的因素,培养基成份；微生物代谢特性；发酵条件改变，如通气量；菌体自溶或杂菌污染。,（五）最适pH的选择与调节,选择pH准则：获得最大比生产速率和合适的菌体量，以获得最高产量。配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况。pH的调节方法：1、调节培养基的配方 2、补料控制 加酸、加碱 增加无机氮源 增加碳源物质 3、调节通气量,八、二氧化碳对发酵的影响及控制,CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢所需的一种基质或生长因子。,（一）CO2来源,（二）CO2对发酵的影响,影响发酵液的酸碱平衡；影响

21、菌体生长、形态及产物合成；CO2及HCO3主要是影响细胞膜的结构；CO2效应：不同微生物或某一生长阶段对CO2有着特殊的要 求，（促进或必需）；CO2通常对菌体生长有抑制作用。排气中高于4时，糖代谢和 呼吸速率下降。发酵液中的CO2浓度为1.610-2mol时，会严重抑制酵母菌的 生长。,（三）CO2浓度的控制方法,1、发酵液中CO2浓度的影响因素：细胞呼吸强度；发酵液流变学特性；通气搅拌程度；罐压大小；设备规模。2、二氧化碳浓度的控制方法：调节罐压、通气量和搅拌速度；补料。（如补糖，增加CO2 产生，降低PH。）,九、泡沫对发酵的影响及控制,（一）泡沫产生的原因,通风和搅拌产生泡沫 微生物代

22、谢气体形成泡沫 泡沫的产生与培养基性质有关 种子和接种量 染菌,（二）泡沫对发酵的危害 泡沫是好氧发酵中的正常现象，但过多的泡沫给发酵带来负面影响：,使装量减少，或造成跑液，使产量降低；通过轴封泄漏，污染设备，增加染菌机会；菌体粘附罐顶、罐壁，发酵液中菌体量减少；影响通气搅拌的进行，造成减产或菌体提前自溶；菌体提前自溶会促使更多泡沫形成，恶性循环；减风量，影响溶解氧浓度，影响生长、代谢；加消泡剂，给提取工艺带来困难。,（三）泡沫的控制,1、机械消泡（耙式消泡桨、超声波、离心等）；2、化学消泡（天然油脂、聚醚类、硅酮类等）；3、从微生物本身特性着手，防止泡沫形成筛选不产生泡沫的微生物突变株。,十

23、、发酵终点的判断及异常发酵情况的处理,（一）确定发酵终点时应考虑的因素1、经济因素 生产指标：产物浓度、生产率、得率、发酵系数等发酵管理及原材料为主要成本时：缩短发酵周期，在产物合成速率降低时放罐。下游提取为主要成本，或产品价值较高时：适当延长发酵时间，达到较高的产物浓度。,2、产品质量因素过早放罐：营养物质残留较多，增加下游提取的难度；过晚放罐：菌体自溶。发酵液成分复杂，提取难度增加，甚至产物发生降解。3、其他特殊因素（二）确定放罐时间的常见指标产物浓度、培养液外观、菌体形态、pH、OD、氨基氮含量等,（三）异常情况的处理,1、污染杂菌的判断 镜检（初期难检出，发现时已严重）平板无菌检测（时间较长）发酵参数异常（DO短时快速下降，且不回升）发酵料液变稀（污染噬菌体或其他原因，DO不回升）,2、染菌后的处理发酵前期：降低培温、重新灭菌、补加营养重新接种等；发酵中期：偏离杂菌最适生长条件，或加入选择性抑菌剂；发酵后期：提前放罐或倒罐。反复污染同一种杂菌：依据其形态判断来源，检查相关设备、菌种等。,3、污染噬菌体的处理灭菌放罐清理生产环境定期消毒调换生产菌株停产整顿加强生产管理选育抗噬菌体菌株,谢谢！,