发酵产物分离纯化.ppt

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1、第六节 发酵产物分离过程,Fermentation engineering,上游工程UPSTREAM PROCESSES,下游工程DOWNSTREAM PROCESSES,发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成：上游工程、发酵工程、下游工程,UPSTREAM PROCESSES-genetics,cell-inoculum development media formulation sterilization-inoculation,上游工程,Fermentation engineering,DOWNSTREAM PROCESSES-product extraction,purification

2、&assay-waste treatmentby product recovery,下游工程,Fermentation engineering,发酵生产流程可以分为三个阶段,上游：运用多种技术筛选出优良的生产菌种；中游：人工或计算机控制的发酵设备中进行微生物的大量培养，并分泌有用的代谢物；下游：将细胞或产物从发酵液中分离纯化出来，从而获得所需的最终产品。,下游加工过程在生物技术中的地位,下游技术（工程）（downstream processing）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终

3、使其成为产品的技术。下游加工过程的重要性。（组成、费用和关注程度）,组成：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品；费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的，而对重组生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的；关注程度：英国政府工业部于年发起生物分离计划（），专门研究下游加工过程；年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国也于年在济南召开了一次专门会议；近十年来国内外有关生物分离或蛋白质纯化的专著陆续出版。,生物产品分离纯化的主要特点,目的产物在初始原料中的含量较低;(2)含目的产物的初始物料组成复杂,除

4、了目的产物外，还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；,(3)目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质；应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。,一、建立分离纯化工艺的根据,1、含目的产物的起始物料的特点2、物料中杂质的种类和性质3、目的产物特性4、产品质量的要求,（1）菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达

5、方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；（2）原材料和培养基的来源及其质量；（3）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等；（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。,物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。,产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩

6、散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。,产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。,分离纯化的一般流程,培养液（发酵液）的预处理和固液分离；初步纯化（提取）；高度纯化（精制）；成品加工。,一般分离纯化过程可分为4个阶段：,预处理和固液分离：目的是分离发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。初步分离：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为精制工序创造有利条件。高度纯化：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。成品制作：成品形式由产品的最终用途决

7、定。,下游加工过程的一般流程,产品的收得率和质量控制。,二、发酵液预处理与固液分离,1、发酵液的预处理2、发酵液的固液分离,1、发酵液的预处理,目 的除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。,1、发酵液的预处理,细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直接过滤；由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在会造成滤液浑浊，滤速极慢；,真菌的菌丝比较粗大，发酵液容易过滤，常不需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤机过滤。放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等

8、胶体。细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分困难，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。,预处理的方法,采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；采用稀释、加热等方法降低粘度，以利于过滤；,凝聚和絮凝技术,凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使它们聚集起来，增大体积，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。,凝聚和絮凝机理,凝聚:电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，范德华吸引力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子絮凝:在某些高分子絮凝剂存在下，使胶粒

9、形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。,凝聚是在中性盐作用下，而使胶体体系不稳定的现象。常用的凝聚剂电解质有：Al2(SO4)318H2O(明矾)；AlC136H2O；FeC13；ZnSO4；MgCO3等。,絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。目前最常见的高分子聚合物絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物。,2、发酵液的固液分离,常用的操作方法有过滤和离心。产胞内产物的菌体收集菌体后需要使细胞破碎。,细胞的破碎方法 按所用方法属性分为物理法（匀浆 法、珠磨法、超声法）、化学法（渗透冲击、增溶法、脂溶法）、生物法（酶溶法）。,物理破碎法 a 高压

10、匀浆法 b 高速珠磨法 c 超声破碎法 d 反复冻融法 e 冷热交替法,化学破碎法a 渗透冲击 利用渗透压的变化破碎细胞。b 增溶法 利用表面活性剂等化学试剂的增溶作用，增加细胞壁和膜的通透性使细胞破碎。c 脂溶法 许多有机溶剂能与细胞壁和膜上的脂质作用，导致细胞壁膨胀、破裂，释放出胞内物质。,生物破碎法 加酶促进法 利用生物酶消化溶解细胞壁和细胞膜的方法。,三、初步纯化,常用的操作方法：沉淀法溶剂萃取法双水相萃取法吸附法蒸发和膜分离法,1、沉淀法,（1）盐析法（2）有机溶剂沉淀法（3）等电点沉淀法（4）非离子型聚合物沉淀法（5）聚电解质沉淀法（6）盐复合物沉淀法（7）热、酸碱变性沉淀法,（1

11、）盐析法,中性盐的加入，破坏了蛋白质、酶的胶体性质，中和微粒上的电荷，促使蛋白质等的沉淀，多用于提取各种蛋白质和酶。中性盐一般为硫酸铵。,（2）有机溶剂沉淀法,与水互溶的有机溶剂（乙醇、丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。多用于生物小分子、多糖、核酸和蛋白质等产品的提取。,有机溶剂在这个过程的主要作用：,降低溶液的介电常数，因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，溶解度降低。有机溶剂的另一作用是部分地引起蛋白质脱水而沉淀。,（3）等电点沉淀法,调节溶液pH至等电点处，可使两性电解质所带净电荷为零，相邻分子之间由于没有静电斥力而趋于沉淀。适用于氨基

12、酸、蛋白质和其他两性物质的沉淀分离。,（4）非离子型聚合物沉淀法,非离子多聚物包括各种不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖右旋糖酐硫酸钠等，应用最多的是PEG。其操作条件温和，不易引起生物大分子的变性，沉淀效能高，很少量的沉淀剂就可以使相当多的生物大分子沉淀，且沉淀后的多聚物也容易除去，无毒、不可燃，对大多数蛋白质有保护作用，因此广泛用于蛋白质、核酸、细菌和病毒等的分离纯化。,2、溶剂萃取法,利用不同物质在不同的溶剂中具有不同的溶解度的原理来进行不同物质的分离纯化。一般采用有机溶剂萃取法适用于抗生素等小分子物质的分离纯化,3、双水相萃取法,双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水

13、中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统。通过溶质在相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。,双水相技术最早出现于1955年。到目前为止,双水相技术几乎在所有的生物物质的分离纯化中得到应用:如氨基酸、多肽、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等,特别是成功地应用在蛋白质的大规模分离中。,典型的两水相系统,双水相萃取的优点,双水相系统之间的传质过程和平衡过程快速,因此能耗较小,可以实现快速分离。易于进行连续化操作。相分离过程温和,生化分子如酶不易受到破坏。选择性高、收率高。操作条件温和。,4、吸附法,吸附作用：固体表面的分子或原子具有不饱和的剩余力，即存在表面力，所以它们

14、能够吸附外界物质，使这些外界物质在吸附剂表面形成多分子层或单分子层，而降低固体表面能，使自身达到稳定状态。一般将物质从流体相浓缩到固体表面的过程成为吸附作用。,作为吸附剂的种类：,无机类 氧化铝、活性碳、硅胶等。有机类 淀粉、纤维素和酰胺凝胶等。,5、蒸发和膜分离法,（1）减压蒸发（2）膜分离法,四、高度纯化,目的是除去各种微量杂质、进一步提高产物纯度，以达到产品规定的纯度要求。常用的方法是各类层析，如离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、疏水层析等，还可用结晶法精制小分子物质。,层析法,层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填

15、有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。,层析法的基本原理,层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,层析技术的分类,(1)按流动相的状态分类：用液体作为流动相的称为液相层析，或称液相

16、色谱；以气体作为流动相的称为气相层析，或称气相色谱。(2)按固定相的使用形式分类：可分为柱层析(固定相填装在玻璃或不锈钢管中构成层析柱)、纸层析、薄层层析、薄膜层析等。(3)按分离过程所主要依据的物理化学原理分类：可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析等。,1、离子交换层析(ion exchange chromatography，IEC),以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别进行分离的一种层析方法。,（1）基本原理,离子交换剂（固定相）是由载体、电荷基团(或功能基团)和反离子或平衡离子构成的，基质与电荷基因以共

17、价键连接，电荷基因与反离子以离子键结合。,离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA+B+RB+A+,离子交换剂根据分离的物质所带电荷不同可分为：阳离子交换剂 阴离子交换剂,阳离子交换剂,阳离子交换剂的电荷基团带负电，装柱平衡后与缓冲溶液中的带正电反离子结合。因此，可以与待分离溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。待分离溶液中可能有正电荷、负电荷和中性电荷。加样后，正电荷基团可以与阳离子交换剂的反离子进行交换而留在交换剂上，负电荷和中性电荷则随流动相流出。然

18、后选用适当的洗脱液将结合的各种正电荷按照与交换剂的结合能力大小不同而洗脱下来。,根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型(带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基的或酚基)三种。,阴离子交换剂,阴离子交换剂是在载体中分别引入季胺-N(CH3)3、叔胺-N(CH3)2、仲胺-NHCH3和伯胺-NH2基团构成的。当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。,Ion exchange chromatography,离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各

19、种离子或离子化合物有不同的结合力。,两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时，它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，pH高于pI时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合。,等电点：当溶液在某一定pH环境中，使蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。,酸性氨基酸pI7,碱性氨基酸pI 7。蛋白质pI与所含氨基酸种类和数量有关，若蛋白质中碱性Aa较多,其pI偏碱。pH与pI的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。,负电荷,正电荷,、离子交换层析基本操作

20、利用离子交换层析分离纯化生物大分子可以采用两种方式：一是将目的产物离子化，然后被交换到介质上，而杂质不被吸附，从柱中流出，称为正吸附。二是将杂质离子化后被交换，目的产物不被交换而直接流出，称为负吸附。,（）离子交换剂的选择（）离子交换剂的预处理、再生和保存,（）离子交换剂的选择 选择合适的离子交换剂：取决于被分离物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电荷则选用阳离子交换剂；如带负电荷则选用阴离子交换剂。选择离子交换剂基质：聚苯乙烯等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质。纤维素、葡聚糖、琼脂糖等交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。,（）离子交换剂的预处理、再生和保存,1)

21、预处理 取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨胀后即可进行处理。常规的处理步骤是，加过量的水悬浮除去细颗粒，而后改用酸碱浸泡，以便除去杂质并使其带上需要的反离子。阳离子交换剂通常为Na型（即活性离子是Na+）阴离子交换剂为Cl型（即活性离子是Cl-）。,2）再生 使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令其恢复原来的性状，这一过程叫再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以借助转型处理完成。所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使用要求带上一定种类的离子或基团。3)保存 一般加入0.02%的叠氮钠，4保存。,（）层析柱 离子交换层析要根据

22、分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1：101：50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。,（）平衡缓冲液 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。,（）上样 离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1%-5

23、%(体积分数)为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。,（）洗脱 在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH 值从高到低。由于pH值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。,（7）样品的浓缩、脱盐 离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高，而且体积较大，样品质量分

24、数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。,2、凝胶层析,凝胶层析的原理：当不同大小分子的酶蛋白混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网状孔大的分子不能进入珠内网状结构而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。,3、亲和层析,亲和层析：根据流动相中的生物大分子与固定相表面偶联的特异性配基发生相互作用，有选择地吸附溶液中的大分子而进行的层析分离方法。基于蛋白质的生物学特性,亲和层析,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、

25、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,亲和层析的应用,1）抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。抗原、抗体间亲和力一般比较强，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。,2)激素和受体蛋白 利用激素和受体蛋白间的高亲和力而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。,3)凝集素和糖蛋白 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，

26、几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。,伴刀豆球蛋白A能结合含-D-吡喃甘露糖苷或-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。,4）多核苷酸和核酸 利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。以DNA作为配体可以用于分

27、离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。,5）辅酶 核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。,6）分离病毒、细胞 利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。,五、成品加工,成品加工还包括浓缩、无菌过滤、去热源、加稳定剂、干燥等步骤。,发酵液特性不同、生产菌种不同、发酵产物类型不同、产物的理化性质不同以及最终产品的形态和纯度不同均可影响提取和精制方法的选择。,选择纯化分离方法和设备的原则：,产品的价值产品的质量和指标目的产物和杂质特殊的理化性质各种可能分离方法的经济对比,