单克隆抗体制备.ppt

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1、问题：,1、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细胞融合有什么不同呢？2、动物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？3、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？两者的融合过程是否也一样？,动物细胞融合与单克隆抗体,1、动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,动物细胞融合,动物细胞融合,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法化学法,仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,细胞融合与融合诱导细胞融合物质：,诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭

2、活？不灭活行吗？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,细胞融合技术应用于哪些方面？,细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。,2、单克隆抗体,什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。,抗体与相应抗原特异性结合,B淋巴细胞与抗体的关系：,、B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。、动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。、每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。,所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么

3、？怎样解决这个问题？,血清抗体（也称多克隆抗体）由血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆抗体。特点：产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。,抗原不纯,抗体不纯,每一个B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，特异性强的抗体。如果利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体单克隆抗体。,问题：怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？,在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？,肿瘤细胞！,科勒,米尔斯坦,荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖,如果把一

4、种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。,单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。特点：特异性强、灵敏度高,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,如何筛选？,融合方式？,如何诱导融合？,加入聚乙二醇（PEG）,如何得到B淋巴细胞？,3.制备单克隆抗体的过程,细胞两两融合后，有哪些

5、类型？,B-B B-瘤(杂交瘤细胞)瘤-瘤,如何筛选出杂交瘤细胞？,单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞,HAT是次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。,细胞合成DNA的原料脱氧核苷酸的合成具有两个途径：1、起始合成（de novo pathway D途径）2、补救（亦称替代或称中间）合成途径，（salvagepathway S途

6、径）即用“次黄嘌呤（H）”和“胸腺嘧啶脱氧核苷（T）”为原料进行补救合成。,用HGPRT型瘤细胞，即缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase）缺陷型变异株瘤细胞（本身无补救合成途径无S途径，只有起始合成途径有D途径），与脾脏的B细胞融合。,瘤细胞本身无补救合成途径（Salvage pa-thway）（不能利用培养基中的H 和T），只有起始合成途径D途径合成DNA。（瘤细胞无氨基喋呤时）只能利用起始合成途径（De novo pathway）D途径（利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸）合成DNA；有氨基喋呤（A），则

7、 D途径被氨基喋呤所阻断。,杂交瘤细胞具有来自脾淋巴细胞的两个途径，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT，起始合成途径（De novo pathway），被氨基喋呤所阻断。但还有补救合成途径（有S途径）起作用。,脾淋巴细胞与杂交瘤细胞一样：，两个途径中，起始合成途径D途径（De novo pathway），虽被氨基喋呤所阻断，但还有补救合成途径（S途径）。但是，本身是高度分化的细胞，不能分裂。,次黄嘌呤,“次黄嘌呤”(英语:Hypoxanthine)也称“6-羟基嘌呤”,是一种天然存在的嘌呤衍生物。6-氨基嘌呤，就是腺嘌呤。,阳性孔,方法抗原-抗体杂交法,第二次在多孔培养板上筛选出能产生特

8、异性抗体的杂交瘤细胞，,如何得到大量的单克隆抗体？,体内培养体外培养,单克隆抗体 化学性质单一、特异性强,2.技术思路的重点,单克隆抗体（McAb）,单克隆抗体制备过程,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,思考：,1、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,应

9、用主要有：,1、临床诊断,2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,4、单抗隆抗体的应用,作为诊断试剂,定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病,用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、特异性强，具有准确、高效、简易、快速的优点。,用于治疗疾病和运载药物,利用同位素标记单抗，在特定组织成像,制成生物导弹，将药物

10、定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。,单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。,用于治疗疾病和运载药物 特异性强、灵敏度高 生物导弹单克隆抗体抗癌药物 疗效高、毒副作用小,结合同位素的单抗,-生物导弹,单抗,放射性同位素,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,小结：,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法灭活病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势,1.动物细胞工程技术的基础是：（）A动物细胞融合B胚胎移植C动物细胞培养D核移植,课堂训练,在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A结果是相同的B杂种细胞的形成过程基本相同C操作过程中酶的作用相同D诱导融合的手段相同,.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞A BC D,C,4、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,