动物细胞融合与单克隆抗体的制备-课件.ppt

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1、,？,再分化,一、原理：细胞膜具有流动性细胞的全能性,二、诱导方法：离心 振动 电激、聚乙二醇,三、用途：获得杂种植株,脱分化,一、动物细胞融合,有些细胞的融合是正常的生命活动。如精子与卵细胞的结合。,(一)概念,动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多 个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,（二）动物细胞融合的过程,与植物原生质体融合原理相同，方法类似。,杂交细胞:融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。,一、动物细胞融合,.原理：,与植物原生质体融合的基本原理相同，即细胞膜的流动性。,.诱导方式：,物理法：,电激、振动、离心,化学法：,聚乙二醇（PEG）,生物法：,灭活的病毒,例

2、如：仙台病毒,仙台病毒,丧失感染性,（不感染细胞）,保留融合活性,（诱导细胞融合）,细胞A,细胞B,杂交细胞,灭活的病毒,物理法化学法,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞膜连接,细胞融合，形成杂交细胞（细胞膜具有一定的流动性）,(三)动物细胞融合的应用,1.突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。,2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。,鼠鸡、鼠兔、鼠猴、人鼠、人兔、人鸡、人蛙、酵母菌鸡、人胡萝卜等,3、重要用途：制备单克隆抗体。,二、单克隆抗体,（一）、什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球

3、蛋白。,三、单克隆抗体,1、抗体是由何种细胞产生的？,浆细胞（效应B细胞）,2、抗体是如何产生的？,B淋巴细胞,抗原,增殖分化成浆细胞,3、一种B淋巴细胞能产生几种抗体？,一种,（二）获得抗体的传统方法,1、把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。,2、缺点：产量低，纯度低，特异性差。,人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。,1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念,用单个B淋巴细胞进行（无性繁殖）克隆，得到的基因型相

4、同的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。,1、在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞有没有可能无限增殖？,不可能,2、我们学过的什么细胞具有这样的能力？,癌细胞,3、有什么办法让B淋巴细胞也具有这样的能力？,细胞融合,一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖,杂种细胞,动物细胞培养技术,（三）、实验原理：,动物细胞融合,创始人：米尔斯坦,单克隆抗体,既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体，,柯勒,如何大量生产单克隆抗体？,利用B淋巴细胞产生抗体的功能。利用肿瘤细胞无限增殖的特性。利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞特

5、性的杂交瘤细胞。利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。,应用：,动物细胞融合,设计方案：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,化学性质单一、特异性强,杂种细胞,单克隆抗体的制备,单克隆抗体的特点：,（四）、单克隆抗体的制备过程,3.过程：,免疫动物,灭活的仙台病毒,？种,BB、B瘤、瘤瘤、,杂交细胞,免疫B细胞和骨髓瘤细胞的制备,细胞融合,杂交瘤细胞的选择培养,杂交瘤细胞的筛选,分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立,单克隆抗体的大量制备,？,？,抗原,效应B细胞,筛选,筛选,过程：,抗原,小鼠,效应B细胞,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,细胞融合、筛选,多孔培养板单个细胞培养，筛选

6、,能产生特定抗体的细胞群,体外培养 体内培养,提取出单克隆抗体,考考你！,1.在制备单克隆抗体的过程中，选用哪两种细胞进行融合？为什么选择这两种细胞？,浆细胞和骨髓瘤细胞浆细胞能产生单一抗体，但不能无限增殖；骨髓瘤细胞能无限增殖，但不能产生单一抗体。,考考你！,2、在这过程中进行了几次筛选？分别在哪个步骤进行筛选？,两次筛选。第一次在B细胞和骨髓瘤细胞融合以后筛选出杂交瘤细胞；第二次在杂交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,五、单克隆抗体的应用,、可用于作为诊断试剂：有准确，高效，简易、快速的优点、可用于疾病治疗、可用于运载药物（作为运载对应疾病的药物的“生物导弹“。）“生物导弹”单克

7、隆抗体药物,小结,细胞,骨髓瘤细胞,细胞融合,浆,筛选,瘤细胞,杂交,细胞培养,选出能产生特定抗体的细胞群继续培养,体外培养,体内培养,从培养液或小鼠腹水中取出,单克隆抗体,通过细胞融合技术获得的杂交瘤细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体。,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,三.细胞工程比较,主要用于制备,单克隆抗体,获得杂种植株,用途,物理、化学法,（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振荡、电刺激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后,诱导细胞融合,去除细胞壁后诱,导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜流动性细胞增殖,细胞膜的流动性、,植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞

8、杂交,比较项目,克服远缘杂交不亲和性的障碍,1、动物细胞融合和植物原生质体融合比较，在动物细胞融合中有特殊性的是（）A、融合的原理 B、融合的优点C、融合的诱导手段 D、融合的过程,2、动物细胞融合的目的中最重要的是（）A、克服远缘杂交不亲和 B、制备单克隆抗体C、培育新物种 D、生产杂种细胞,3、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）A、经过免疫的B淋巴细胞 B、不经过免疫的T淋巴细胞 C、经过免疫的T淋巴细胞 D、不经过免疫的B淋巴细胞,4.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤

9、细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融 合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞 A B C D,5、研究单克隆抗体治疗癌症的思路是（）A利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞 B以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞C抗癌物质在克隆细胞中大量合成D单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细胞结合,6只能使动物细胞融合的常用诱导方法（）APEG B灭活的病毒 C电刺激 D离心7、“生物导弹”是指（）A.单克隆抗体 B.杂交瘤细胞 C.产生特定抗体的B淋巴细胞 D.在单抗上连接抗癌药物,8、下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，不正确的是（）AB淋巴细胞与骨髓瘤细

10、胞的融合，一般不 需要灭活的仙台病毒或聚乙二醇诱导B融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又 能产生单克隆抗体C体外培养时，一个效应B淋巴细胞可以产生 抗体，但不能无限增殖D单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵 敏度高，优越性明显,A,9.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞 A B C D,C,在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特

11、异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。,杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。,思考与探究,1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？,植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。,诱导融合方法不同：动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。,2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？,哺乳动物感染抗

12、原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。,知识拓展,3.为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？,就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、

13、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,知识拓展,4.如何进行杂交瘤细胞的抗

14、体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,知识拓展,6.单倍体的诱导方法及应用价值,单倍体（haploid）是指具有配子染色体数目

15、的个体。单倍体可以自发产生，也可以诱发产生。动物中（除蜜蜂、白蚁等外）的单倍体，由于生理上不正常，在胚胎发育时期就会死亡。植物上自发产生单倍体的植物很多，如番茄、棉花、咖啡、甜菜、大麦、小麦、油菜等，共有约10个科26个属36个种的植物可以自发产生单倍体。除了自发产生单倍体外，人工诱导产生单倍体的方法有：（1）种间和属间杂交。由于远缘杂交，虽然不能受精，但在远缘物种的花粉诱导下，卵细胞可以在未受精情况下发育成胚，这种情况在马铃薯、大麦、小麦、玉米中都可以发生；（2）物理和化学诱变。花粉经射线照射或化学药品处理失去受精能力，但仍可以刺激卵细胞发育成胚；,（3）双生苗筛选。有些植物可以产生多胚种子，即23个胚共处于一个种皮中，这样的种子可以形成单倍体植株；（4）花药或花粉培养。单倍体具有很好的应用价值：在植物育种上，单倍体经过加倍可以使后代迅速纯合，缩短育种年限；由于单倍体经加倍后，在理论上各基因位点应处于纯合状态，对后代进行选择时，选择到的个体代表着真实的变异，避免了杂交育种中杂交优势对选择个体的干扰，提高了选择效率；用单倍体作为转基因的受体，获得的转基因材料经加倍后基因即可纯合，避免了体细胞作为受体，会由于后代分离需要多代选择的麻烦。目前以油菜小孢子作为转基因受体已得到转基因植株。,