动物细胞工程2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体.ppt

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1、我们知道，运用植物体细胞杂交技术，可以跨越植物种属间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，能不能采用类似的方法，让不同种动物的体细胞进行杂交呢？科学家经过长期的探索，终于实现了这样的设想。,动物细胞融合与单克隆抗体 动物细胞融合,细胞膜的流动性。,动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,1、动物细胞融合的概念 2、动物细胞融合的原理,3、动物细胞融合的过程,动物细胞融合与单克隆抗体 动物细胞融合,动物细胞融合与单克隆抗体 动物细胞融合,3、动物细胞融合的过程,融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞,把A、B两种动物细胞混合在一起

2、，用聚乙二醇处理后，会获得几种杂交细胞？它们分别是什么？你知道杂交细胞的特性吗？,动物细胞融合与单克隆抗体 动物细胞融合,4、动物细胞融合的意义,细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。至今种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。,目前，这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术,为制造单克隆抗体开辟了新途径。,5、动物细胞融合的应用,几个问题：1、为什么灭活的病毒能作为诱导剂？2、什么是灭活？3、不灭活的病毒能作为诱导剂吗？,2、什么是灭活？用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染

3、能力，但不破坏抗原结构。,3、不灭活的病毒能作为诱导剂吗？不能，因为不灭活的病毒会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,1、为什么灭活的病毒能作为诱导剂？病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开,细胞发生融合。,动物细胞融合与单克隆抗体 动物细胞融合,请比较动物细胞融合与植物体细胞杂交。,原理、方法、手段、结果、用途,例-动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是A.诱导融合的方法完全相 B.所用的技术手段完全相同C.所采用的原理完全相同 D.都能形成杂种细胞,D,动物细胞融合与单克隆抗体 动物细胞融合,动物细胞

4、融合与单克隆抗体 单克隆抗体,复习回忆：1、抗体（1）概念：机体受抗原刺激后产生的，并且能与之发生特异性结合 的具有免疫功能的球蛋白。（2）产生细胞（3）分布,2、淋巴细胞（1）分类 B淋巴细胞和T淋巴细胞（2）来源 起源于造血干细胞；一部分造血干细胞在骨髓分化成B淋 巴细胞；一部分造血干细胞在胸腺分化成T淋巴细胞。（3）浆细胞的来源 B淋巴细胞受抗原刺激或记忆细胞受同一种抗原的刺激。,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体,复习：免疫的过程,B淋巴细胞,抗体,记忆B细胞,刺激,产生,与相应的抗原特异性结合,浆 细胞,结论：,1.B淋巴细胞受到特定抗原的刺激后产生特定抗体；即：每一个B淋巴细胞只

5、分泌一种特异性抗体,2.一种抗体只能与一种抗原发生特异性结合。,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体,阅读-思考:传统的抗体生产方法如何？有什么缺点？,传统的抗体生产方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。,缺点：产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。,由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。,阅读-思考:如何解决“传统的抗体生产”这一缺点？,为了解决这一难题，科学家们进行了多年的研究和探索。他们发现，哺乳动物感染病原体(如病毒，细菌等)后，体内会形成相应的B淋巴细胞。B淋巴细胞能分泌抗体，凝聚或杀死这

6、些病原体。动物在免疫反应的过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体,事实（已知）:1.高等动物的B淋巴细胞能产生抗体，对抗侵入体内的细菌和病毒等病原体，维护身体健康。为了增强人体的免疫力，临床上常常需要大量的医用抗体。由于用传统方法制备的是含有多种抗体的混合抗体。不能专一性的对付某一类病原体，因而治疗效果差。若采用单个的B淋巴细胞进行无性繁殖，形成细胞群，这样的细胞就能产生化学性质单一、特异性强的抗体(需求)。可惜的是，在体外的条件下，B

7、淋巴细胞不能无限繁殖。2.而在体外培养的条件，肿瘤细胞（如骨髓瘤细胞）具有无限增殖的特性。3.动物细胞能融合成杂交细胞。,推想（未知）：由上述事实，请你大胆想象并设计出制备单一抗体(单克隆抗体)的方案？,事实推想,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体,思考:但在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，那么，科学家是怎样解决这一问题的呢？,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的制备,1975 年，英国科学家米尔斯坦和柯勒在前人工作的基础上，继续探索和尝试，并且充分发挥思像力，设计了一个极富创造性的实验方案（右图）。他们想到，如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细

8、胞进行融合，所得到的融合细胞就能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。,用羊的红细胞对小鼠进行注射，使小鼠产生免疫反应，从产生免疫反应小鼠的脾脏细胞中，他们得到了抗羊红细胞的抗体，这说明在小鼠的脾细胞中形成了相应的B淋巴细胞。,1、如何使小鼠脾脏细胞具有抗羊红细胞的抗体(相应的B淋巴细胞)?,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的制备,2、如何获得杂种细胞?,设法将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中产生的B淋巴细胞融合，再用特定的选择性培养基进行筛选。在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的制

9、备,这种杂种细胞的特点是既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体。,3、这种杂种细胞的特点是?,单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。,补充：对上述经选择性培养的杂交瘤细胞，为什么还需进行克隆化培养？,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的制备,杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细

10、胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。,对上述经选择性培养的杂交瘤细胞，还需进行克隆化培养和抗体检侧(为什么)，经多次筛选(为什么)，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的制备,将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖，这样，从细胞培养液或小鼠腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体了。,如何培养获得大量单克隆抗体？,回答1:什么细胞能无限增殖呢？回答2:你如何解决淋巴细胞无限增殖这个问题呢？回答3:骨髓瘤细胞有何特点?它在这项技术中担当何角色?回答4:你认为杂交

11、瘤细胞有什么特点？为什么？回答5:你能想象出单克隆抗体生产的过程吗？,4.既有骨髓瘤细胞的特点在体外培养可大量增殖；又具有B淋巴细胞特点产生抗体。具有两种细胞的遗传特性。,1.肿瘤细胞。,2.让淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合产生杂交瘤细胞。,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的制备,3.在体外培养条件下大量增殖。,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的制备,细胞融合,多种杂交细胞,如何促使融合？PEG、灭活的病毒、电激等,克隆上述杂交细胞,培养,培养、提取,用什么培养基？作用是什么？筛选作用的培养基 筛选出杂交细胞,克隆上述杂交细胞之前须什么检验？专一抗体检验阳性(能产

12、生专一抗体),将不同杂种细胞分开，并克隆专一抗体检验阳性细胞,培养有两种方法?,杂交细胞有什么特点?,1、单克隆抗体的优点 特异性强，灵敏度高，可以大量制备；,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的应用,阅读-回答:单克隆抗体的优点及应用?,2、单克隆抗体的应用（1）可用于作为诊断试剂 单克隆抗体最广泛的用途是用作体外诊断试剂，它在多种人类疾病及动植物病害的诊断和病原鉴定中发挥着重要的作用。由于单克隆抗体纯度高、特异性强，所以能准确地识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，因此，单克隆抗体在诊断的应用上，具有准确、高效、简易，快速的优点。利用同位素标记的单克隆抗体,

13、在特定的组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。,2、单克隆抗体的应用（1）可用于作为诊断试剂（2）可用于疾病治疗和运载药物 主要用于治疗癌症；制成运载对应疾病的药物的“生物导弹”“生物导弹”单克隆抗体药物 单克隆抗体（单抗）与相应细胞发生特异性结合；药物治疗作用；,用于治疗疾病和运载药物从目前临床试验来看，单克隆抗体主要用于癌症治疗，也有少量用于其他疾病的治疗。单抗药物剂型种类繁多，有单独使用的，也有与同位素、毒素、药物结合使用的。如果把抗癌细胞的单克隆抗体跟放射性同位素、化学药物或细胞毒素相结合，制成“生物导弹”，注入体内，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到您细胞所在位

14、置，在原位杀死癌细胞。这样既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量(优点)。因此，作为一种疗效高、毒副作用小的新型药物-“生物导弹”将有广阔的应用前景。,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的应用,动物细胞融合与单克隆抗体 单克隆抗体 单克隆抗体的制备,P551.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。,P552.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。,