动物细胞培养改.ppt

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1、第四章 动物细胞与组织培养,动物细胞培养、组织培养和器官培养,动物细胞培养指将动物的某一组织取出，分散成单细胞，在人工培养条件下使之存活、生长和增殖的技术；动物组织培养指从动物体内取出组织并模拟体内生理环境，使之在体外人工条件下生存和生长，并维持其结构和功能不变的技术；（生长晕，outgrowth，组织周围形成的单层贴壁生长细胞）器官培养：模拟体内生理环境，将整个器官、器官的部分或器官的原基进行培养，使之在体外存活、生长和保持一定功能的技术。（维持其结构和功能不变，维持细胞的分化状态）,动物细胞培养技术的应用：,A、生产蛋白质生物制品-病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等B、大面积烧伤病人皮肤移植C

2、、检测有毒物质D、利用培养的正常或病变细胞为治疗疾病提供理论依据,一、动物细胞工程史二、动物细胞的特点三、动物细胞培养方法四、影响动物细胞生长的环境因素五、动物细胞大规模培养六、组织工程七、器官培养八、干细胞,一、动物细胞工程史,1.起始阶段 1907年，美国的Harrison(哈里森)采用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织，观察到了细胞生长现象，开创了动物细胞培养先河。1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。,1923年,卡雷尔在悬滴培养的基础上，设计了用卡氏瓶培养离体的动物组织，使组织培养进入一个迅速发展的阶段。培养瓶的形状主要是适合

3、细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。卡式瓶可以较好地保证无菌环境，为细胞提供生长空间。为动物细胞体外大量培养发挥了重要作用。,1951年，Earle等人开发了供动物细胞体外培养的培养基。Gey(1951)首建人肿瘤细胞Hela细胞系。Hayflick(1961)首建人二倍体细胞系25种。（世界各国建立统一细胞贮存库。如ATCC美国标准细胞库,1985年成立了中国典型培养物保藏中心:1990年中科院建立了细胞库。）,细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958年,Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。60年代，Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存

4、活。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型，利用HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。,1958年,Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。1965年，哈里斯和沃特金斯证明了灭活的病毒在控制条件下可诱导细胞融合。7

5、0年代至80年代，利用动物细胞培养获得蛋白等生物制品迅速发展，在医学中发挥巨大作用。,2.大发展时期 细胞融合技术使得人们可以在细胞水平上进行生命组合。美国耶路大学组装出一只黄、白、黑毛的杂毛鼠。英国组装成功了绵羊和山羊的嵌合体绵山羊。,1977年，英国采用胚胎技术成功培育出世界上首例试管婴儿；2004年结婚，2006年自然分娩一男婴；全球试管婴儿已超300万,1997年，英国首次克隆出了体细胞动物绵羊“多莉”。2001年，英国成功培育出世界首批转基因克隆猪,适用于人体移植手术使用的动物器官。,2007年3月26日美国科学家培育出首只人兽羊，有15的部分属于人类（喀迈拉（Chimera），是古

6、希腊神话中一个长着狮子头、羊身体、蛇尾巴的吐火怪物。）,二、动物细胞的特点,1.体外培养动物细胞类型2.体外培养动物细胞的特点3.动物细胞群体生长特性,1、体外培养动物细胞类型 贴壁依赖型（anchroage-dependent cell)：有机体的决大多数细胞必须贴附在某一固相支持物上才能生长。（体外条件下同样）,上皮细胞型成纤维细胞型游走细胞型多形型细胞,按照培养细胞的主要形态，可分为,上皮细胞型：,成纤维细胞型：呈梭型或不规则三角形，胞质突起，生长时呈放射状。起源于中胚层的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。,人肝肿瘤细胞,游走细胞型：胞质常突起，呈活跃游走或变形运动

7、，方向不规则，贴在支持物表面呈散在生长，一般不连成片。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。,人大肠癌扫描电镜图 细胞株：lovo呈梭形，表面有许多微绒毛，并伸出许多伪足(4080),多形细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,神经胶质细胞和神经元细胞,非贴壁依赖型(悬浮生长型细胞 suspend cell)：来源于血液、淋巴组织的细胞、杂交瘤细胞、肿瘤细胞和转化细胞,小鼠T细胞,2.动物细胞离体培养的生长特点,贴附：贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养时的基本生长特点接触抑制(contact inhibition)：细胞由于接触而抑制运动的现象。是区分正常细胞

8、和癌细胞的标志之一密度抑制(density inhibition)：培养液中营养减少，细胞密度增大，导致细胞分裂停止；,（1）与植物细胞不同，动物细胞除卵细胞外，都只有遗传上的全能性而没有细胞的全能性。（2）在体外细胞培养时，除癌细胞和血细胞外，正常的动物细胞都有贴附于支持物上生长的特性，并且会因发生接触抑制而停止分裂和增殖。（3）所有高等动物的正常细胞都是有寿限的，细胞分裂最多不能超过50代次；而植物细胞没有寿限。,离体培养动物与植物细胞的区别,3、体外培养动物细胞的生长与增殖,单个细胞的生长过程（细胞周期）整个细胞系的生长过程(细胞系的演化）每代细胞的生长过程,原代培养：直接从机体取出细胞

9、、组织、器官立即进行培养（制成细胞悬浮液）到再一次转接重新培养的一段时间。传代培养：原代培养的细胞继续转接培养的过程。细胞系:经过成功传代培养的细胞。有限细胞系（finite cell line）：细胞系生存有限，传到一定代数即停止生长；无限细胞系（immortal cell line）：能维持无限繁殖能力，可以连续传代的细胞系；细胞株：从细胞培养物中，筛选出的具有特殊性质的或特异标记的单个细胞经克隆形成的细胞群体。饱和密度：在特定条件下，培养容器内能达到的最高细胞数，当细胞达饱和密度后细胞群体停止繁殖。（个/平方厘米；个/立方厘米）,相 关 概 念,整个细胞群体生长过程(细胞系的演化）：,原

10、代培养期,传代期,衰退期,培养细胞不同时期特点,培养细胞生长曲线（单培养周期）,潜伏期：刚接种,呈悬液；促贴附物(纤粘连蛋白fibronectin等)作用下,细胞贴壁铺展,基本无分裂。指数增生期(3-5天）：增殖旺盛阶段,活力最好,数量增多,密度增大，发生接触抑制,运动停止；平台期（停止期）：细胞量达饱合密度、不增殖,进一步发展细胞脱落、死亡。（达80%，传代）,每代细胞的生长过程,转化细胞：利用物理化学因子或病毒感染等人工方法获得的细胞系肿瘤癌细胞：自发形成的转化细胞,又叫永生细胞 特点比正常细胞分裂代数多不受细胞密度影响没有接触抑制现象细胞形状不规则，出现异常染色体,连续细胞系,三、动物细

11、胞培养方法,1.常用培养基天然培养基合成培养基无血清培养基其他常用液：平衡盐水 pH值调整液 细胞消化液 抗生素溶液2.培养方法动物细胞培养过程培养方法动物细胞组织培养污染的防治,常用：牛血清（小牛血清、胎牛血清）和马血清,天然培养基,三、动物细胞培养方法,1.常用培养基天然培养基合成培养基无血清培养基其他常用液：平衡盐水 pH值调整液 细胞消化液 抗生素溶液,合成培养基,常用：199、109培养基：1950年Morgan等为培养鸡胚组织设计,含有60种成分,为全面培养基,广用于各类细胞培养。基础Eagle培养基(BEM）：1955年Eagle设计,BSS12种氨基酸谷氨酰胺8种维生素。简单、

12、便于添加,适于各种传代细胞系和特殊研究用,在此基础上改良的有:（MEM、DMEM、IMEM）McCoy5A培养基：1959年MeCoy为肉瘤细胞设计，BSS40种成分,尤对原代和难于培养细胞较好。Ham F10、F12培养基：1963年、1969年Ham设计，含微量元素,可在血清含量低时用,适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞,特适于羊水细胞培养。,三、动物细胞培养方法,1.常用培养基天然培养基合成培养基无血清培养基其他常用液：平衡盐水 pH值调整液 细胞消化液 抗生素溶液,无血清培养基(serum medium,SFM)不加动物血清，在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子和促贴壁

13、的物质（粘连蛋白）。来源：已知成分，关键是补充生长因子和激素；胰岛素和转铁蛋白几乎是所有细胞株必须的。特点：避免了血清培养基造成的后期培养产物分离提纯和检测困难、来源少和成本高的缺点，利于深入研究细胞生长发育、分裂增值及衰老分化的生物学机制。常用：NCTC135、SFRE199-1已商品化上市。中国仓鼠细胞培养专用无血清培养基（CHO Cell Culture SFM）、基因治疗细胞培养专用无血清培养基(Gene Therapy Cell Culture SFM),三、动物细胞培养方法,1.常用培养基天然培养基合成培养基无血清培养基其他常用液：平衡盐水 pH值调整液 细胞消化液 抗生素溶液,平

14、衡盐水（BSS）由生理盐水和葡萄糖制成，提供动物细胞生命活动所需基本成分和代谢所需能源，并保持一定缓冲能力。特点：维持渗透压、控制酸碱平衡,提供能量和无机离子、配培养用液基础液、细胞洗涤液。加入少量酚酞指示剂可直观显示pH值的变化，升高变紫红色、降低变黄色，中性为桃红色。常用：Hanks液缓冲能力较弱；Earle液缓冲能力较强；磷酸缓冲液成分简单，也较常用。,三、动物细胞培养方法,1.常用培养基天然培养基合成培养基无血清培养基其他常用液：平衡盐水 pH值调整液 细胞消化液 抗生素溶液,pH值调整液：需要单独配，单独灭菌，4度低温保持，培养基灭菌后使用前加入，如过量用灭菌的10醋酸或通人CO2调

15、整。常用：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液；HEPES液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸）缓冲能力强，对细胞无毒。,三、动物细胞培养方法,1.常用培养基天然培养基合成培养基无血清培养基其他常用液：平衡盐水 pH值调整液 细胞消化液 抗生素溶液,细胞消化液：细胞培养前用消化液把组织块解离成分散细胞或传代培养时使贴壁细胞分散解离。常用：胰蛋白酶溶液：能水解细胞间的蛋白质。常配成0.125和0.25%两种浓度，用无钙离子和镁离子的溶液配制，调pH6.87.2，消化结束时用少量血清或含血清的培养基终止酶作用。EDTA溶液（Versen）：对细胞有非酶性解离作用。经济方便、毒性小、易配制，为常用的消

16、化液。消化新鲜组织时，常将上述二者以一定比例混合（1：1或1：2），效果更佳。,三、动物细胞培养方法,1.常用培养基天然培养基合成培养基无血清培养基其他常用液：平衡盐水 pH值调整液 细胞消化液 抗生素溶液,抗生素溶液：常用适量的抗生素，以防止微生物污染：青、链霉素(双抗）：青霉素主要对革兰氏阳性菌有效；链霉素主要对革兰氏阴性菌有效。常溶于Hanks液配成母液，最终浓度为100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。卡那霉素：对革兰氏阳性菌和阴性菌有效，抑制细菌蛋白质的合成。常溶于Hanks液配成母液，最终使用浓度为50ug/ml。制霉菌素：对真菌有效，干扰细菌细胞质膜的合成。制成5000U/

17、ml的悬液，使用时最终浓度为25U/ml。,三、动物细胞培养方法,1.常用培养基2.培养方法动物细胞培养过程培养方法动物细胞组织培养污染的防治,2.1动物细胞培养过程 材料的选取 组织消化 细胞培养 细胞传代培养细胞的检测：（污染物、细胞活力、pH等）培养细胞的保存：冷冻保存，超低温（196）的液氮,2.培养方法,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。2悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形

18、成细胞悬液再传代。3半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。,体外培养动物细胞传代方法,2.2 动物细胞的培养方法,微载体,微导管,贴壁材料,生长阶段,固定化培养,悬浮培养,微生物污染：细菌性：污染后培液混浊、pH;霉菌性：霉菌污染可见菌丝体。支原体、病毒细胞交叉污染化学物质污染,无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。,2.3 动物细胞组织培养污染与防治,（1）.支原体无细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径0.2um，可通过滤器。目前通过对国内100余株/系细胞的检测，污染率达30%60%。从国外引进细胞株/系

19、也经常出现支原体的污染。污染后，通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细胞的融合率，干扰实验结果。,支原体污染,（2）.支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现。,（a）.相差显微镜观察；（b）.低张处理地衣红染色法；（c）.荧光染色法；（d）.酶标法；（e）.PCR法,支原体检测的方法:,荧光染色法（Hoechst33258）显示染色体，细胞周围亮点为支原体,扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体,1.防有毒害物污染：关键是正确处理洗消器皿用具。2.预防微生物污染：灭菌和除菌；无菌操作；应用抗生素

20、;加温处理；体内外巨噬细胞净化消除。,污染的预防和消除,一、动物细胞工程史二、动物细胞的特点三、动物细胞培养方法四、影响动物细胞生长的环境因素五、动物细胞大规模培养六、组织工程七、器官培养八、干细胞,四、影响动物细胞生长的环境因素,五、动物细胞大规模培养,动物细胞大规模培养是指在人工条件下，在生物反应器(bioreater)培养系统高密度大量培养动物细胞生产生物制品，再通过相关的纯化手段浓缩纯化其产物的技术。,动、植物细胞培养和微生物培养的比较,动植物细胞培养和微生物培养的比（续）,对结构复杂，二硫键多，并且翻译后的修饰对蛋白活性的影响很大的蛋白，采用原核表达系统往往不能满足蛋白表达的需要许多

21、用于防治人类疾病的糖蛋白，原核细胞根本无法表达。新生物技术药物：哺乳动物细胞表达的重组蛋白与天然蛋白在结构和功能上保持很高的一致性。,1.动物细胞大规模培养的应用A.病毒疫苗：乙肝疫苗、狂犬疫苗、脊椎灰质炎疫苗 疫苗主要成分为免疫性蛋白质，通常与基因技术相结合，将能表达特定免疫蛋白的基因转入合适的动物细胞进行高效表达和实现高密度培养，生产相应的疫苗产品。,实例,乙肝基因工程(CHO)疫苗:用基因工程技术将乙型肝炎表面抗原基因片段重组到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)内，通过对细胞培养增殖，增殖分泌乙肝表面抗原(HBsAg)于培养液中，经纯化后制成。(美国Genentech公司应用SV40为载体)Ve

22、ro细胞(非洲绿猿猴色肾细胞）和狂犬病毒：,Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺,DMEM培养基,胎牛血清,其他成分,锥形瓶逐级放大培养,加碱（碳酸氢钠）,加糖（葡萄糖）,灌注培养液,微载体,5L种子罐培养,培养液,50L生物反应器,接种狂犬病毒,出液口,收获病毒,B.非抗体免疫调节剂：干扰素（IFN)、白细胞介素（IL）、B细胞生长因子（BCGF）、巨噬细胞激活因子（MAN）等,英国Wellcome公司采用8000L Namalwa细胞生产干扰素。英国Celltech公司用气升式生物反应器生、和干扰素；,干扰素是一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白，具有抑制病毒的作用，但不能杀灭病毒。作用机

23、制：作用于细胞后使细胞产生多种其他蛋白，从而阻断病毒复制过程。自1975年发现干扰素以来，经历了自然干扰素（白细胞干扰素、成纤维干扰素和T细胞干扰素）、基因重组干扰素和蛋白质工程干扰素三个主要阶段。,C.单克隆抗体MCAB：杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。它具有特异性强、能够大量生产的两大显著优点。动物细胞大规模培养生产单克隆抗体是一种经济、可靠的途径。,英国Celltech公司用无血清培养液在10000L气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。,把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，使之接近于人类抗体的天然结构，从而消除了 人体免疫系统对鼠源性单克隆

24、抗体的免疫反应。人源化单克隆抗体“泰欣生”，人源化程度达到95%,CDR移植技术(单克隆抗体人源化)：,D.多肽生长因子：神经生长因子、表皮生长因子、血清生长因子（美国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生长激素等。）E.激素：红细胞生成素、促黄体生成素F.肿瘤特异性抗原:癌胚抗原(CEA)癌胚抗原(CEA)是首先在结肠癌病人的血清中发现的一种球蛋白，在胎儿36个月的血清中可以检测到，所以称作癌胚抗原。,目前我国批准上市的哺乳动物细胞尤其是CHO细胞表达的产品很少，只有促红细胞生成素（EPO）、CHO基因工程乙肝疫苗、以及治疗性抗

25、体药物益赛普（有效成分相当于美国食品药品管理局批准的Enbrel）和泰欣生（有效成分相当于美国食品药品管理局批准的Erbitux）等少数几种生物技术药物；美国FDA在2000年1月2004年12月批准上市的31种生物技术药物中，约70%为哺乳动物细胞表达的重组蛋白。,现 状,哺乳动物细胞大规模培养技术,百泰的发酵系统由瑞士制造,2.培养方式,生物反应器反应器工艺流程发展趋势,动物细胞培养生物反应器设计依据,生物反应器种类：1.悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、气升式反应器；2.贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反应器、

26、陶质矩形通道蜂窝状反应器；3.包埋培养用反应器：如流化床反应器、固化床反应器。,反应器工艺流程,分批培养（batch culture）流加式培养（fed-batch culture）半连续培养（semi-continuous culture）连续培养（continuous culture）灌流式（perfusion culture）,2.1分批式培养（batch culture）：一次性转入生物反应器，在培养过程中体积不变，不添加其它成分，一次性收获细胞、产物、培养基。,特点：操作简单；培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。直观反映细胞生长代谢的过程；可直接放大。,常用搅拌式生物反应器分批式培养

27、单抗,采用微囊或巨载体培养。美国Genentech使用CHO細胞以12,000L培养槽生产t-PA重组蛋白以及治疗癌症的生物药物组织型纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)和重组型纤维蛋白溶酶原激活物(rt-PA).,搅拌式生物反应器,2.2流加式培养：悬浮培养，根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，当细胞核产物达所需指标，一次性取出。特点：细胞培养时间较长，总密度较高，产物浓度较高。流加培养过程须掌握细胞生长动力学，能量代谢动力学，研究细胞环境变化时的瞬间行为。可采用工艺参数的直接放大。是当前主流优势的培养工艺，关键技术是基础培养基和流加浓缩的营养培养基。,2.3 半连续式

28、培养：悬浮培养形式，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。特点：培养物的体积逐步增加，细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。可进行多次收获，长时期进行生产；细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。,2.4 连续式培养：在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。特点：细胞维持持续指数增长；产物体积不断增长；可控制衰退期与下降期。,特点：维持较高的细胞密度，提高了产品的产量；较好的的营养环境中，有害代谢废物

29、浓度积累较低；培养周期较长，目标产品回收率高；产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。用于生产分泌型重组治疗性药物和嵌合抗体，以及人源化抗体等基因工程抗体。,2.5 灌流式:培养过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。(只取培养基,不取细胞),目前国际上，动物细胞的培养方式发展趋势为悬浮连续式；当前已获FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌注培养。国际上，Genzyme，GeneticInstitute，Bayer(德国)等公司都采用连续灌流工艺。,http:/=32

30、613,发展趋势,华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,西安细胞工程发展中心（第四军医大学）,陈志南教授,国家八六三计划生物工程技术主题专家，国家药品监督管理局药品审评专家，中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会副主任委员；长期从事肿瘤分子免疫学、细胞生物学和肝癌免疫导向药物的研究与应用，在该领域取得了突出成绩。,2003年，发现了个对病毒有明确抑制作用的多肽 2005年获得治疗原发性肝癌的单抗导向同位素药物-碘美妥昔单抗注射液,3.培养过程筛选、开发所需的细胞系确定细胞生产的营养和环境条件放大开始中试扩大生产,存在的主要问题：细胞密度低、产物浓度低；细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力

31、易丧失，或产物活性易降低。培养基、培养基设备及培养用微载体昂贵，难以转化为生产力；对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺；在线监测水平技术不完善，限制了优良培养系统的开发。,4.动物细胞体外培养现状与展望,展望机制方面的理论研究。开发能高密度生长、大量分泌目标产品的细胞系。开发细胞生长性能优良、易分离，能重复使用、新型廉价的微载体。研制高效的培养模式与系统相关基因工程与细胞培养技术结合的技术研究,六、组织工程(Tissue Engineering),技术概述应用进展实例,技术概述,1、定义：应用细胞生物学和工程学原理，将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增，

32、然后移植到人体所需要的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的的一种技术。,2、组织工程的三要素细胞、支架、信号,2、组织工程技术三个基本要素：种子细胞、支架(细胞外基质)信号(生长因子）,A、细胞必须能不断进行细胞分裂，且必须能被调控分化成特定的组织细胞干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞组织来源细胞：自体或异体,Growth factor stimulation,种子细胞,B、组织生长支架需求：,细胞外基质（extracelluarmatrix,ECM）:生物相容性好、可被人体降解吸收的组织工程支架材料称为胞外基质.,理想的ECM应具有以下特点：,生物相容性好，在体内不引起炎症反应和毒性反应有可吸

33、收性，能彻底地被自身组织所取代；有可塑性，可塑为任意的三维结构，植入后在体内仍可保持特定形状；表面化学特性和表面微结构利于细胞的粘附和生长；降解速率可根据不同细胞的组织再生速率而进行调整。,蛋白质支架多糖支架磷酸钙基生物材料硫酸钙基生物材料,作用:细胞增殖提供营养物质，有助于氧和二氧化碳交换、废物排泄；自身能逐渐被人体降解、吸收和排泄。,表皮生长因子（Epidermal Growth Factor）：人体内分泌的一种重要的生长因子，极微量即能强烈促进皮肤细胞的分裂和生长;还能剌激细胞外一些大分子如透明质酸和糖蛋白等的合成和分泌，滋润皮肤。神经生长因子（NGF）：为神经细胞特异性分泌的营养蛋白。

34、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）：一种能刺激肝细胞增生的分子骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)：能诱导或刺激新骨的生成。,C、生长因子,（1）体外得到工程化组织、移植目前主要的方式（2）细胞与支架前体混合注射体内，原位形成凝胶支架，提供新组织形成的空间,3、技术路线,皮肤修复,骨修复,治疗过程,Source:Integra LifeSciences Corporation,Source:Integra LifeSciences Corporation,双层人工皮肤Apligraf,组织工程人工骨缺损修复示意

35、图,二、应用,修复缺损器官:自体 移植：拆东墙补西墙异体移植：免疫排斥，数量有限组织代用品：与人体相容性差、易感染利用人体残余器官的少量正常细胞进行体外培养，获得患者所需的、具有相同功能的器官，不存在排斥反应。,组织工程学研究与经济发展的关系,据Vacanti及Ianger的一项调查表明，美国每年花在有器官及组织损害病人身上的资金高达4 000多亿美元，几乎占全美国医疗费用的一半。美国的医院每年要为这些病人作800万例次手术，然而并不能挽救每一个人的生命或避免残废。每年约有4 000人在等待器官移植时死亡，还有约10万人在未被列入等待器官移植时就已死亡。用于骨缺损修复的骨移植手术在美国务医院是

36、仅次于输血的组织移植手术。,组织工程学前景广泛,约有1 000万人因尿道功能失调，尿失禁或尿液返流，等待组织工程产品植入治疗；约有100万个膝关节半月软骨等待替代；每年有1000万例牙科手术，其中需新放入9 000万个充填物，另有2亿个过去放入的充填物需要更换。每年约有200万例以上的皮肤慢性溃疡，其中50万例系糖尿病性肢体缺项血，需要组织工程化皮肤移植治疗。,病患需要组织工程材料协助治疗者,皮肤烧伤2,150,000人/年。骨关节置换558,200人/年。骨移植275,000人/年。骨科内固定480,000人/年。血管移植1,360,000人/年。肾移植600,000人/年。输血18,000

37、,000人/年。牙科材料10,000,000人/年。,1990年，美国马萨诸塞大学的查尔斯瓦康季首次用裸鼠的肋骨在老鼠背上成功培育出人的耳朵的软骨；曹谊林教授(国家“973”组织工程首席科学家)，1996年成功在无免疫功能的裸鼠体内再造了“人耳”；1997年，Organogenesis公司研制的与人类皮肤相同的Apligraf，是第一个获得食品及药物管理局（FDA）批准的人造组织。它最初用于治疗腿部溃疡，也可用于治疗足部溃疡和烧伤。,三、进展,还成功地在兔子耳朵上复制出“人耳”；培养箱里培养出来了“体外再生耳朵”。2003年，“人骨再造”，抽取自身骨髓基质干细胞，诱导分化成为骨细胞，体外培育再

38、造一块颅骨，植入体内后与原先的头骨相融共生。,2002，著名生命科学家徐荣祥教授领导的科研小组已成功在体外人工培养出神经。,徐荣祥面对质疑：五年肯定克隆所有人体器官,显微镜下的毛囊细胞,2003，英国通过为膝盖受损的病人进行自体细胞组织培养的方，再造一个新膝盖，成功率达80。2005年4月2日，裴国献教授利用显微外科技术，构建出带血管的组织工程化羊骨，并以此修复缺损的羊胫骨获成功。首次在大动物体内构建出了带血管的人工骨，这标志着我国在组织工程研究领域又迈出了关键性的一步。,另外，目前再生的和实验室培育的骨骼、软骨、血管和皮肤，以及胚胎期的胎儿神经组织都在进行人体试验;肝脏、胰脏、心脏、乳房、手

39、指和耳朵等正在实验室里生长成形。此外，科学家 们甚至正在尝试培育出能充当药物释放渠道的组织。唾液腺能分泌抗真菌蛋白质；皮肤能释放生长激素。,不用剥动物皮而做皮衣的新办法 据俄罗斯媒体报道，研究人员奥隆卡茨和约纳丘尔摹仿生物体发明一种生物反应器，往里面放进去动物皮的活细胞，结果培育出衣袖、后襟和领子一应俱全的皮大衣。“繁殖”肉;“消除种族区别”。,皮肤替代物 美国FDA批准美国加利福尼亚州一家公司生产的商品名为TransCyte的皮肤替代物进入市场。它由取自皮肤真皮或表皮层的细胞在一个生物可降解的聚合物上生长而成。TransCyte 能作为创口的临时覆盖物，可用于2 度或3 度烧伤的病人。,Bo

40、dy-Part Shack肢體臟器量販店,可能嗎?,四、实例：哈佛医学院-猎犬膀胱 首先，从猎犬膀胱的外表面获取平滑肌细胞，在膀胱内表面获取尿上皮细胞，在体外培养。其次，应用多分支的、多孔渗水的聚羟基乙酸聚合体，塑造了一个膀胱形状的模子，再在其表面涂上聚乳酸类物质。第三步，将尿上皮细胞加到聚合体膀胱的内表面，平滑肌细胞加到外表面，然后进行无菌培养。7 天后，通过外科手术，用新生长成的膀胱分别替代6 只小猎犬的正常膀胱。3 个月后，聚合体在新膀胱组织中消失，小猎犬的机体开始用自身的血管供应新膀胱，新膀胱和正常的膀胱一样能容纳尿液，并维持正常的膀胱形态，甚至还接受机体神经支配。,织工程面临的挑战,

41、零部件工厂欲求之特性面向患者,小结,七、器官培养,定义和特点培养技术实例研究进展,1.定义和 特点,器官培养主要采用类似于组织培养中植块培养的方式培养器官型植块。特点：培养对象为胚胎组织的某一器官或非胚胎组织器官的一部分；被培养物浸泡在培养液中，细胞增殖，器官保持正常功能；被培养组织器官的细胞靠简单的深透扩散方式从培养液中获得氧气和其他营养物质，并排泄废物。,2.培养技术,胚胎器官培养：可整体培养，培养时不需要补充氧，细胞生长活跃，迁移能力强。成年器官培养：对氧的要求高，细胞高度分化，内部细胞的迁移不明显。培养时注意两个基本原则：提供充足的营养和氧，及时排除代谢废物；要抑制细胞从植块向外迁移。

42、,3.实例,血管的培养 材料：成年哺乳动物的胸动脉A.麻醉大鼠并常规消毒，固定后剖开胸部，取出胸动脉，用培养液冲洗动脉内壁，剪成3.5mm左右的动脉管。B.将动脉管放入培养瓶中，加入10ml左右的培养液，并向培养瓶中通入95氧和5CO2的混合气体，加塞。C.放入37度培养箱中培养。,4.进展,最早是由Leob在1897年对成年兔的一些器官进行了尝试性培养，3天内保持正常。20世纪初，利用胚胎器官培养的研究活跃；20世纪50年代，器官培养进入蓬勃发展阶段。西南医院利用裸鼠培养出的小鼠的肾脏。目前，培养的人体器官已达18种以上。指骨、动脉、肾脏、乳房、人造膀胱、人造角膜都在积极的实验培养阶段，有待

43、于应用。,定义特性和分类培养和建系应用,八、干细胞培养,干细胞（stemcells）是一种具有多分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，形成多种组织和器官。（干细胞:哺乳动物的许多已分化组织和器官中都保留了一些能够分裂形成该组织或器官的未分化原始细胞，这些细胞称为干细胞。）,1.定义,2.特性和分类,形态：呈圆形或椭圆型、体积小、核质比例较大（图）；具有较高的端粒酶活性，因此具有较强增殖能力。增殖：增殖速度较慢，利于进入特定分化程序，避免产生自身突变。自稳性，干细胞会自我更新维持自身数目。,生长在培养液中的人胚胎干细胞(周围是小鼠“喂养”细胞),从分化潜

44、能性分 单能干细胞：分裂产生的子细胞只能分化为单一类型的细胞。如：表皮干细胞。多能干细胞：能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。如：骨髓造血干细胞 全能干细胞：具有无性分化潜能的干细胞。能专门分化胚胎和胚后期组织、器官。从来源分 成体干细胞：成体组织中具有自我更新及分化产生子代细胞的未成熟细胞。胚胎干细胞（ESC）：着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可分化成任何一种组织类型的细胞。,干细胞分类,把小鼠胚胎干细胞植入小鼠大脑（见左图的蓝色背景）之后，形成了类似于神经细胞的细胞（见左图棕色部分及右图）,干细胞发育成神经细胞,3.培养和建系,(1).ESC的

45、获得 A.从早期胚胎获得：桑椹胚、囊胚。小鼠选用3.5天的囊胚或2.5天时1620细胞的桑椹胚；牛取67天的桑椹胚或78天的囊胚；人取78天的囊胚。B.从原始生殖细胞中获取：哺乳动物原始生殖细胞最早出现在靠近尿囊基部的卵黄囊内胚层，后期移向生殖脊。大鼠取10.5天的尿囊中胚层或13.514.5天的生殖脊；人取59周龄的胎儿背肠系膜或生殖脊。,（2）.建系过程A.ES细胞的分离获得B.ES细胞的分化抑制培养：ES细胞体外培养极易分化或丧失正常二倍体核型，必须进行分化抑制培养。采用饲养层抑制物：选用STO（小鼠胎儿成纤维细胞）、UE（子宫上皮细胞）等细胞以丝裂霉素C阻断有丝分裂后制备成细胞单层。使

46、用条件培养基：饲养单层细胞培养一定时间后，收集细胞培养液，处理后加入培养基中;或直接向基本培养基中添加细胞分化抑制因子LIF(白血病抑制因子)。C.细胞系建立：内细胞团（ICM)细胞，经消化、分散后，进行抑制分化培养，获得ES细胞；扩增培养，建立细胞系，2天换液一次，34天继代一次。,（3）.培养和诱导分化 ES细胞培养方法和分化抑制培养相似，采用饲养层培养法和无饲养层培养法。诱导分化：加入一些无机物或有机酸等，使胚胎细胞渗透压改变导致轻度损伤，诱导细胞分化。加入类固醇激素、多肽因子等诱导物与被诱导细胞表面受体结合而诱导分化。诱导分化得到特定的细胞和组织，在组织、器官修复和基因治疗方面具有重要

47、应用。,（1）应用干细胞治疗疾病有着广泛的前景。目前，在干细胞生物学上已能在体外鉴别、分离纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞、原始生殖干细胞以及多种组织干细胞。用干细胞治疗疾病的设想已进入实践检验。造血干细胞工程产品如骨髓、扩增及定向诱导分化的造血细胞和免疫细胞、转基因的基质细胞等，已经进入临床应用。造血干细胞移植已成为治疗白血病、各种恶性肿瘤放、化疗后引起的造血和免疫系统功能障碍等疾病的重要手段。,4.应用,（2）干细胞为解决组织工程所需要的细胞带来了希望。组织工程用来修补由于意外损伤等引起功能丧失的体内组织，满足临床康复的需要，并有可能对一些目前尚无根治办法的疾病，如恶性肿瘤、帕金森病、中风等

48、提供解决方案。以干细胞工程为代表的现代组织工程是一个迅速发展的新领域。,干细胞的产生及进行组织修复,产生人胚胎干细胞的胚泡,胚胎干用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经过一定的处理使其发育成囊胚，再利用囊胚建立细胞，在体外进行诱导分化成特定的组织或器官，再将这些组织或器官移植到病人身上。利用干细胞技术，将从根本上解决同种异体器官移植过程中最难的免疫排斥反应问题，同时还较好地解决了组织器官的来源问题。,（3）利用干细胞技术体外克隆人体器官用于移植治疗。,（4）干细胞研究将大大改进药品研制和进行安全性实验的方法。新的药物治疗方法可以先用人类细胞系进行实验，如癌细胞系。胚胎干细胞提供了新药的药理、

49、药效、毒理及药物代谢等细胞水平的研究手段，大大减少了药物实验所需动物的数量。胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发生机制和发展过程，以便找到持久有效的治疗方法。,干细胞技术治疗疾病要解决4个问题：一、来源：研究发现脂肪中一些细胞可发育成健康组织，可能代替从胚胎组织或骨髓中提取干细胞；二、如何把干细胞转化成病人所需的功能细胞；三、如何克服免疫排斥；四、如何诱导干细胞形成一个具有一定解剖结构的脏器。此外，还存在一些伦理道德上的争论。,干细胞的研究和应用的难点,第四章 动物细胞与组织培养,一、发展史二、动物细胞的特点三、动物细胞培养方法四、影响动物细胞生长的环境因素五、动物细胞大规模培养六、组织工程七、器官培养八、干细胞,章 结,