动物细胞与组织培养-成体干细胞详解.ppt

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1、成体干细胞部分,概念：成体干细胞，成体干细胞包含哪些类别？各有何特点？成体干细胞在医学中的应用,一、概 论,20世纪初，Pappenheim等首次提出了成体干细胞的概念。胚胎干细胞继续进行分化，形成具有特定功能的干细胞，这些专门化的干细胞统称多能干细胞。在胎儿、儿童和成人组织中存在的多能干细胞统称“成体干细胞（Adult stem cell）”。如血液干细胞可分化成白细胞、红细胞和血小板;皮肤干细胞可形成各种不同类型的皮肤细胞。,成体干细胞是指一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新、并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞 1997年Wilmut用体外培养的、高度分化的母羊乳腺

2、细胞核移植入去核卵细胞，克隆出了新绵羊“Dolly”克隆羊的诞生表明：高度分化的体细胞仍具有完整的遗传信息，能重新编排发育程序，指导胚胎发育成为一个完整的新个体。,成体干细胞具有跨越组织或胚层分化的特性称为成体干细胞的可塑性或横向分化,2001年斯坦福大学的Blau博士等人对成体干细胞提出了一个全新的概念：成体干细胞是来自许多不同类型细胞（包括已分化细胞）的一种“状态”，这类细胞不仅存在特定组织中，还可通过血液到达躯体的各个部分，参与各种组织的再生和修复,成体干细胞是一种处于尚未分化的、处于干细胞/祖细胞/前体细胞状态的成体细胞，它来源于成年和未成年个体的组织干细胞。在正常生理条件下，它倾向于

3、更新、并分化为所在特定组织的若干种细胞。但在特殊条件诱导下，成体干细胞能超越特定组织、分化呈其他组织的功能性细胞，参与其他损伤组织的修复,最近几年的研究表明，这些干细胞的分化能力远 超过传统观点局限的范围。例如骨髓成体干细胞在合适的体内外环境中可长期生长，也可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、骨髓基质细胞及多种血管内皮细胞。还可形成一种肝脏前体细胞肝卵园细胞，神经、胶质细胞和心肌细胞。高度纯化的造血干细胞可分化形成肝细胞、内皮细胞和心肌细胞；骨骼肌细胞能分化出造血细胞；中枢神经系统干细胞可形成血液细胞、肌肉和许多其它体细胞。成体干细胞这种跨系统分化特性称为“可塑性（P

4、lasticity）”。,二、成体干细胞的可塑性,1、骨髓干细胞,各种血细胞,内皮细胞脂肪细胞成纤维细胞,HSC和MSC的分化全能具有很大的可塑性，可分化为甚至跨越胚层的各种类型细胞，如神经细胞、软骨细胞，骨细胞，干细胞、肌肉细胞等不同类型的细胞,间质干细胞（MSC）,造血干细胞（HSC）,骨髓干细胞,a.间质干细胞,间质干细胞在体外培养时，可分化为内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉等细胞的潜能 MSC细胞在异常环境中，细胞分化的可塑性增加,b.造血干细胞 造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。HSC表面存在一些标志，可用流式细胞仪和免疫

5、磁性分选技术从骨髓细胞中分离和纯化出HSC。HSC移植到不同的环境可分化为各种不同类型细胞。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。,神经干细胞是神经系统中一类能自我更新、并产生神经原和神经胶质细胞的前体细胞,2、神经干细胞,神经干细胞等只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。说明成体干细胞的分化潜能已经受到一定限制。,神经干细胞移植发现，神经干细胞分化为神经细胞的潜能具有发育的依赖性，说明神经干细胞的分化潜能已受到一定的限制。但体外培养移植试验表明在一定的为环境下仍有可塑性。1999年Bjounson将神经干细胞分化成造血细胞。开创

6、了成体干细胞跨越组织和胚层分化研究的先例。,神经干细胞的可塑性,神经干细胞的分布 神经管形成以前,在整个神经板检测到神经干细胞的选择性标记物神经巢蛋白(nestin),是细胞的骨架蛋白。神经干细胞主要存在于神经发生区：海马回和次脑室区,此外，成年嗅球、皮层、室管膜层或者室管膜下层、纹状体、海马的齿状回颗粒细胞下层等脑组织中分布着神经干细胞。研究发现脊髓、隔区也分离出神经干细胞 脊髓损伤时,来自于神经干细胞的神经元新生受到抑制,而神经胶质细胞明显增多,其机制可能与生成神经元的微环境有关。,3、肝干细胞,1958年Wilson等认为肝组织中存在着干细胞，因为肝组织均有营养损伤和部分切除时再生能力。

7、肝卵圆细胞能在体外大量增值，细胞移植后可分化为肝细胞和胆管上皮细胞，表明肝卵圆细胞是肝干细胞。,肝干细胞的可塑性,肝干细胞移植到胰腺和十二指肠时可分化胰腺细胞和肠上皮细胞，表明肝干细胞在适当的微环境中能被诱导分化为内胚层的其他组织细胞。丁酸钠或二甲亚砜可诱导肝干细胞分化为肝细胞转化生长因子（TGF-bata）或肝细胞生长因子（HGF）可诱导肝干细胞分化为胆上皮细胞,4、骨骼肌干细胞,肌肉的生长、更新和修复是由肌纤维周围的卫星细胞介导的即骨骼肌干细胞骨骼肌干细胞不仅可分化为肌肉，而且可分化为血液细胞成分。具有分化的可塑性,四、成体干细胞的体外培养和特性,1、骨髓间质干细胞半世纪来造血干细胞移植治

8、疗血液病、自身免疫病和遗传疾病取得瞩目的进展。间质干细胞（MSC）能向软骨、骨、脂肪、造血基质和神经原样等细胞分化。使其首选为组织工程中的种子细胞。MSC主要来源于骨髓，还可来源于脂肪组织吸取物（PLA）,2、造血干细胞,造血干细胞来源于胚胎期的肝脏和骨髓。全能造血干细胞可分化为多能淋巴干细胞和髓性造血干细胞全能造血干细胞 造血祖细胞 造血前体细胞判断造血干细胞通常用体内间接法。脾脏中造血灶称为集落形成单位（CFU）造血干细胞的表面抗原CD34 为强阳性,3、神经干细胞,神经干细胞体外培养和建系，必须满足两个基本条件：1.具有永生化特性 2.具有神经干细胞世系遗传明显特性，即神经干细胞表型。,

9、神经干细胞的特点 神经干细胞可以分化通过分裂产生相同的神经干细胞来维持自身的存在,同时,也能产生子细胞并进一步分化成各种成熟细胞神经干细胞通过两种方式生长,一种是对称分裂,形成两个相同的神经干细胞;另一种是非对称分裂,由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀的分配,使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化细胞,另一个子细胞则保持亲代的特征,仍作为神经干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。,神经干细胞由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞

10、功能的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应。如：给帕金森氏综合症患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经干细胞，可治愈部分患者症状。,五、成体干细胞研究中的问题,1、异质性可塑性可能是由于混杂的几种和不同类干细胞分化的结果一些干细胞可塑性使用，人们质疑所谓“可塑性”可能是混杂几种或一群不同类型干细胞分化的结果干细胞的异质性在遗传学种是指由于不同遗传机制而产生的相同或类似的表现型异质性在某种程度上是干细胞固有的特性。,2、干细胞所处环境,干细胞所处的环境对于干细胞的分化命运有着重要影响。干细胞所处的环境之间精巧而默契的协调作用可能是干细胞“可塑性”的

11、重要原因,对于干细胞“可塑性”现象的解释有4种：1）机体有多种来源和不同分化方向的成体干细胞群体，能分布定向的向各自来源的细胞分化2）机体存在多潜能成体干细胞，微环境导致不同分化方向3）特定组织来源的成体干细胞除分化为特定组织细胞外，可重新编程，分化为其他细胞。4）某种成体干细胞与特定组织来源的干细胞发生融合，产生“杂交细胞”，获得向后者分化潜能。可塑性的调控受外源性因素和内源性因子调控,3、可塑性的调控,4、分化细胞的功能,可塑性研究的结果大多是基于检测新生组织的特定蛋白或标志物，很少检测分化细胞的功能，但有限不同细胞具有相同的标志物。欲提供干细胞的终末分还状态，应基于细胞表面标志鉴别和细胞

12、功能证明两方面的依据。如神经细胞移植后，可塑为血细胞，即要检测起表面标志，又要检测其造血的功能。,5、体外增殖,成体干细胞分离后，目前尚无有效的能较长期在体外维持未分化状态并大量增殖的体外培养方法。常用的手段：1）分离的干细胞直接移植入动物或病人2）体外将干细胞诱导分化为所需的成熟细胞，随后进行移植。如皮肤干细胞移植到烫伤病人，虽可愈合，但不能产生汗腺。,六、成体干细胞在再生医学中的应用,在医学中，可利用成体干细胞于创伤修复、疾病的细胞治疗、整形外科学和组织工程学等需要组织工程的核心是由种子细胞和生物活性材料构成三维空间复合体具有足够数量并保持特定生物学活性的重组细胞是组织工程最基本的要素。,

13、1、组织工程化皮肤,完全克隆是皮肤真正的干细胞，具有超常的自我更新能力，可被作为皮肤移植的种子细胞，且P63蛋白是角质细胞干细胞的标志物,2、组织化骨骼,骨骼涉及三维立体结构，所需组织包括骨、软骨、脂肪、血发生支持基质等。必须由适当的生物活性材料构建成三维支架进行培养,3、骨髓组织工程,骨髓至少含两类干细胞（HSC和SSC）能产生血管、骨、软骨、骨骼肌、心肌、肝以及神经细胞等在组织工程中常优先考虑作为种子细胞来源。优点：容易收集，具有明显的表面标志物,七、成体干细胞的去向,成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的去向。或者

14、产生新的干细胞。或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,（1）细胞内蛋白对干细胞分裂的调控:细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位。（2）转录因子的调控,1.内源性调控,2.外源性调控,（1）分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。（2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。（3）整合素与细胞外基质 整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。,八、成体干细

15、胞优势,1、成体干细胞可从患者自身获得，而不存在组织相容性的问题，治疗时可避免长期应用免疫抑制剂对患者的伤害。胚胎干细胞免疫排斥，因此要对患者进行长期免疫抑制剂治疗或将患者的造血系统和外来细胞形成嵌合体。治疗性克隆：将患者的体细胞核移植到去核的健康供体卵细胞中，在体外克隆并随后发育分化产生携带患者自己MHC的胚胎干细胞。胚胎干细胞发育分化过程中极高的非整倍体发生率。体细胞克隆所需的卵细胞难以获得。,2、胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是“非定位性”的。当前的做法容易导致畸胎瘤。在应用胚胎干细胞治疗前，必须先进行初步的细胞诱导分化，以防止畸胎瘤的发生。也必须确认胚胎干细胞供者没有诸如（

16、肌）营养失调症之类的遗传性疾病。相对而言，成体干细胞不存在上述问题，例如骨髓移植实验并不引发畸胎瘤。,3、成体干细胞也具有类胚胎干细胞的高度分化能力有科学家提出了成体干细胞研究的新假说，即在人体发育的过程中，成体干细胞是存留在多种组织中、具有多系分化能力的亚全能干细胞群体，这些细胞都具有相同或相似的细胞表型，在适合的微环境下可分化成多种组织细胞。成体干细胞移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。,五、干细胞技术应用,1.疾病治疗研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死

17、性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合症，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。,2.体外制造人体器官干细胞和动物工程的结合将有可能解决这一问题。比如通过形成嵌合体，在严格的控制下，使动物的某些器官来源于人体干细胞。这些来自人体干细胞的器官可应用于临床移植治疗。,（1）应用干细胞治疗疾病有着广泛的前景。干细胞的应用涉及到医学的多个领域。目前，在干细胞生物学上已能在体外鉴别、分离纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞、原始生殖干细胞以及多种组织干细胞。用干细胞治疗疾病的设想已进入实践检验。造血干细胞工程产品如骨髓、扩增及定向诱导分化的造血细胞和免疫细胞、转基因的基质细胞等，已经进入临床应用。

18、造血干细胞移植已成为治疗白血病、各种恶性肿瘤放、化疗后引起的造血和免疫系统功能障碍等疾病的重要手段。,干细胞技术对医学研究和治疗技术将产生重大影响：,组织工程是利用细胞培养技术在体外人工控制细胞分化、增殖并生长成需要的组织，使之批量产出，用来修补由于意外损伤等引起功能丧失的体内组织，满足临床康复的需要，并有可能对一些目前尚无根治办法的疾病，如恶性肿瘤、帕金森病、中风等提供解决方案。以干细胞工程为代表的现代组织工程是一个迅速发展的新领域。,（2）干细胞为解决组织工程所需要的细胞带来了希望。,体外克隆人体器官应用于临床移植治疗是干细胞研究的重要方向。其目标是用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经

19、过一定的处理使其发育成囊胚，再利用囊胚建立胚胎干细胞，在体外进行诱导分化成特定的组织或器官，再将这些组织或器官移植到病人身上。从理论上讲，利用干细胞技术，将从根本上解决同种异体器官移植过程中最难的免疫排斥反应问题，同时还较好地解决了组织器官的来源问题。,（3）利用干细胞技术体外克隆人体器官用于临床移植治疗，将引起传统治疗方式的重大变革。,多能干细胞使更多类型的细胞实验成为可能。新的药物治疗方法可以先用人类细胞系进行实验，如目前的癌细胞系就是为这种实验建立的。虽然这些实验不可能取代在动物和人体进行的实验，但这会使药品研制的过程更为有效。胚胎干细胞提供了新药的药理、药效、毒理及药物代谢等细胞水平的

20、研究手段，大大减少了药物实验所需动物的数量。胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发生机制和发展过程，以便找到持久有效的治疗方法。,（4）干细胞研究将大大改进药品研制和进行安全性实验的方法。,目前干细胞的研究和应用还存在很多难题。用干细胞技术治疗疾病,首先要解决4个问题：一是干细胞的来源二是如何把干细胞转化成病人所需的功能细胞三是如何克服免疫排斥四是如何诱导干细胞形成一个具有一定解剖结构的脏器。此外，还存在一些伦理道德上的争论。,20世纪五十年代，临床上就开始应用骨髓移植（BMT）方法来治疗血液系统疾病。八十年代末，外周血干细胞移植（PBSCT）技术逐渐推广，绝大多数为自体外周血干细胞移植（APBSCT），提高治疗有效率和缩短疗程。脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不高，不易受病毒或肿瘤的污染。2002年初，我国东北地区首例脐血干细胞移植成功，又为中国造血干细胞移植技术注入新的活力。,