分析化学李娜定分课件8-Basic.ppt

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1、第八章,吸 光 光 度 法,第八章 吸光光度法,8.1 吸光光度法的基本原理8.2 光度分析的方法和仪器8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度8.4 显色反应与分析条件的选择8.5 吸光光度法的应用8.6 紫外可见分光光度法在有机 定性分析中的应用,获诺贝尔奖的仪器分析项目(1),W.H.Bragg&W.L.Bragg(英)物理奖 1915应用X射线研究晶体结构 F.W.Aston(英)化学奖 1922用质谱法发现同位素并应用于定量分析 F.Pregl(奥地利)化学奖 1923开创有机物质的微量分析法 F.Bloch&E.M.Purcell(美)物理奖 1952发明核磁的测定方法 A.J.P.Ma

2、rtin&R.L.M.Syngc(英)化学奖 1952开创气相分配色谱分析法,武大仪分p3,获诺贝尔奖的仪器分析项目(2),J.Hegrovsky(捷)化学奖 1959 开创极谱分析法 R.Yalow(美)生理医学奖 1977 开创放射免疫分析法 K.M.Siegbahn(瑞典)物理奖 1981 发展高分辨率电子光谱学并应用于化学分析 R.R.Ernst(瑞士)化学奖 1991 发展高分辨核磁共振波谱学方法 A.Zewail(美籍埃及人)化学奖 1999 利用激光闪烁研究化学反应,化学分析：利用化学反应及其计量关系来进行分析的方法。仪器分析：采用比较复杂或者特殊的仪器设备，通过测量物质的某些物

3、理或物理化学性质的参数及其变化来确定物质的化学组成、成分含量及化学结构的一类分析方法。化学分析与仪器分析的关系？,1672,Isaac Newton,1802,Willian Hyde WollastonDark lines from the solar spectrum with a spectroscpoe,Bunsen-Kirchhoff Spectroscope1759-1860,光学分析法,（不以光的波长为特征讯号，通过测量电磁辐射的某些基本性质的变化的分析方法。）,（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法。）,分子光谱学(1),*者为

4、四大波谱*紫外可见分光光度法(UV/Vis)Ultra Violet/Visible Spectrophotometry*红外吸收光谱法(IR)Infrared Spectroscopy分子荧光光谱法(MFS)Molecular Fluorescence Spectroscopy分子磷光光谱法(MPS)Molecular Phosphorescence Spectroscopy,分子光谱学(2),光声光谱法(PAS)Photo Acoustic Spectroscopy拉曼光谱法(RS)Raman Spectroscopy*核磁共振波谱法(NMR)Nuclear Magnetic Resona

5、nce Spectroscopy*质谱法(MS)Mass Spectroscopy 联用技术发展很快,物质的量与仪器的信号的联系,Sample,Converter,Reading,1.3 定量分析方法（2）,按试样量大小分：方法 固体试样质量(mg)液体试样体积(mL)常量 100 10半微量 10100 110 微量 1%)微量组分(0.01-1%)痕量组分(0.01%),复习第一章,测量光强度的减弱,吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。,怎样测量光强的减弱？-分光光度计。,光强的减弱如何与物质的浓度联系起来？-朗伯-比尔定律。,物质为何对光有选择性吸

6、收？-准备知识。,那些物质可以用分光光度法测定，如何设计实验-方法及应用,吸光光度法,特点(p293)灵敏度高：测定下限可达105106mol/L,10-4%10-5%准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差25（12）操作简便快速应用广泛,8.1 吸光光度法的基本原理,8.1.1 物质对光的吸收与受激发光8.1.2 光吸收基本定律朗伯-比尔定律8.1.3 吸光度的加和性及吸光度的测量,光的基本性质 电磁波的波粒二象性(1),c真空中光速 2.99792458108m/s3.0 108m/s波长，单位：m,cm,mm,m,nm,1m=10-6m,1nm=10-9m,1=10-10m频率，单位

7、：赫芝（周）Hz 次/秒 n折射率，真空中为1,光的传播速度:,波动性,光的基本性质 电磁波的波粒二象性(2),磁场向量,电场向量,传播方向,Y,Z,X,与物质作用,光的基本性质 电磁波的波粒二象性(3),h普朗克(Planck)常数 6.62610-34Js频率E光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)1eV=1.6021019J,微粒性,光量子，具有能量。,光的基本性质 电磁波的波粒二象性(4),结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低。单色光：具有相同能量(相同波长)的光。混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在 一起。例如,白光。,波粒二

8、象性,真空中:,物质分子内部3种运动形式及其对应能级：,1.电子相对于原子核的运动-电子能级;2.原子核在其平衡位置附近的相对振动-振动能级;3.分子本身绕其重心的转动-转动能级.,物质对光的吸收与发射,双原子分子的能级图,单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反。三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同。,Ee,振动能级,v3,v2,v1,转动,r3,r2,r1,S1,S0,S2,紫外,荧光,磷光,T2,T1,单重态能级,三重态能级,可见,Ev,Er,红外,光谱种类,电磁波谱及分析方法,光学光谱区,10nm200nm,200nm 380nm,380nm 780nm,780 nm 2.5 m,

9、2.5 m 50 m,50 m 300 m,吸收光颜色,不同颜色的可见光波长及其互补光,一些材料的有效透明区,300,400,500,600,700,/nm,350,525 545,Cr2O72-,MnO4-,Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱,350,不同物质吸收光谱的形状以及max不同定性分析的基础同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax不同定量分析的基础,光吸收基本定律:朗伯-比尔定律,朗伯定律:(1760)A=lg(I0/It)=k2b意义:当入射光的,吸光物质的c和溶液的t一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.,光吸收基本定律:朗伯-比尔定律,比尔定律(1852)A=

10、lg(I0/It)=k4c意义:当入射光的,液层厚度b和溶液的t一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.,光吸收基本定律:朗伯-比尔定律,意义:当一束平行单色光通过均匀、非散射的溶液时，其吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比.,A=lg(I0/It)=kbc,透光率(透射比）（Transmittance）,A=lg I0/It=lg(1/T)=-lgT=Kbc,吸光度（Absorbance）,吸光度A、透射比T与浓度c的关系,1968年IUPAC规定用4个量 A,T,b,当吸光物质浓度为1molL-1,液池厚1cm时，一定波长的光通过溶液时的吸光度值。是物质本性决定的，表示灵敏度。51

11、05 高,物理意义：,最常用的形式：Abc,A、T、b、k的名称,AkbcA吸光度 Absorbance光密度 Optical Density 用D或O.D表示消光度 Extinction 用E表示T 透射比 Transmission 透光度（率）Transmittanceb 样品光程（Sample Path Length),单位为cm。一般为吸收池厚度。,K 吸光系数 Absorptivity 消光系数 Extinction Coefficient 吸收指数 Absorbancy Index当c的单位用gL-1表示时，用a表示，Aabc当c的单位用molL-1表示时，用表示.A bc 摩尔吸

12、光系数 Molar Absorptivity 或称摩尔吸光指数 Molar Absorbancy Index当c的单位用g100mL-1表示时，用 表示，A bc，叫做比消光系数(Specific Extinction Coefficient).,吸光度与光程的关系 A=abc:,吸光度与浓度的关系 A=abc,吸光度与波长的关系A=abc,0.00,b,朗伯-比尔定律的局限性,当溶质浓度很高（一般0.01mol/L)时，分子之间的距离与分子大小相比，静电作用影响摩尔吸光系数的偏离样品中粒子的散射待测样品在测定波长下发荧光或磷光在高浓度的电解质溶液中，折射指数发生变化随着浓度的增加，化学平衡发

13、生移动非单色光发射，尽量选用max处测定杂散光,吸光度的加和性,在含有多组分体系的吸光分析中，往往各组分对同一波长的光有吸收。溶液的吸光度等于各组分的吸光度之和：,A=A1+A2+An,8.2 光度分析的方法和仪器,8.2.1 光度分析的几种方法 目视比色法 光电比色法 分光光度法 8.2.2 分光光度计的类型,目视比色法,通过眼睛观察比较溶液深浅来确定物质含量的方法。,观察方向,光电比色计结构示意图,722分光光度法,滤光片,W灯,光门,722型分光光度计光学系统,基础分析化学实验p92,722型分光光度计结构方框图,基础分析化学实验p93,分光光度法的基本部件,分光光度计的主要部件（1）,

14、光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度且不随而改变。稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯 紫外区：氢灯，氘灯单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。分光元件：滤光片，棱镜，光栅吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃 紫外区：石英,分光光度计的主要部件（2）,检测器：利用光电效应，将光强度转换成 电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管检流计（指示器）：将信号以适当方式显示 或记录。低档仪器：刻度显示 中高档仪器：记录仪，数字显示,典型光源的发射光谱,钨灯：发射波长 3202500nm 可见光区光源氢灯：发射波长180375nm 紫外光区光源氙灯：紫外、可见光区均

15、可用作光源,光源,分光元件（1）,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时有不同的 折射率而将不同波长的光分开。玻璃：3503200nm石英：1854000nm,单色器,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大 的等宽等间距条痕。平面透射光栅 反射光栅（广泛使用）原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。,分光元件（2）,反射光栅：紫外、可见：600、1200、2400条/mm 红外 2030条/mm,滤光片（用在光电比色计上）,吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光通过，其他波长的光均被吸收的滤光片(用于可见光区)。,分光元件（3）,国产581型光电比色计,常用的几种滤光片,玻璃滤光片：由各种有色玻璃制

16、成，60nm夹胶滤光片：用有机染料使塑料薄膜着色后夹在 光学玻璃中制成,30nm40nm干涉滤光片：根据光的干涉作用而设计的，10nm。(用于紫外光区)选择滤光片的原则：滤光片透光率最大的光是有色溶液吸收最大的光。即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补。,吸收光谱法应用的检测器,硒光电池（Barrier-layer photocell）,适用于300-800 nm,在500-600 nm范围最灵敏。,Se,阴极Au，Ag,半导体,h,阳极,硒光电池（Barrier-layer photocell）,待扫描,光电管(phototube),h,（片）,光电管,红敏管 625-1000 nm蓝敏管 20

17、0-625 nm,光电倍增管,待扫描,160-700 nm,1个光子可产生106107个电子,722型分光光度计,光源：钨卤素灯12V、30W波长范围：330800nm分光元件：光栅，1200线/mm检测器：端窗式G1030光电管 多碱阴极真空管 300850nm波长精度：2nm光谱带宽：6nm波长精度：仪器波长指示器所显示的波长值与仪器对应输出的实际波长值之间的符合程度。可用二者之差来衡量。,吸光光度法仪器主要差异比较,单光束分光光度计,可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图,双光束分光光度计(Double-beam-in-space),双光束分光光度计(Double-beam-in-ti

18、me),Varian Cary 1E 分光光度计光路图,3035mm1200条/mm,30转/s,Varian Cary 1E 紫外可见分光光度计,双光束型可以消除单光束仪器受光源强度变化的影响,I0,I0,IR,IS,光源,光电管,几种类型分光光度计的比较,多通道仪器（Multichannel Instruments）,光电二极管阵列 photodiode arrays(PDAs)纤维光度计,其他类型分光光度计,HP 8452A多通道二极管阵列分光光度计,镀铝反射镜,纤维光度计示意图,纤维光度计,8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度,8.3.1 灵敏度的表示方法 摩尔吸光系数 桑德尔(Sand

19、ell)灵敏度8.3.2 影响准确度的因素对比尔定律的偏离,灵敏度，S,Sandell灵敏度定义：截面积为1cm2的液柱在一定波长或波段处，测得吸光度为0.001时所含物质的量。用S表示，单位：gcm-2由 A=bc A/bc(cmmol/1000cm3)0.001/L,S越小，方法的灵敏度越高S大多在0.010.001 gcm-2,例,已知用邻二氮菲光度法测定铁时，5081.1104 Lmol-1cm-1S=55.85/(1.1104)0.0051 gcm-2用4,7-二苯基邻二氮菲光度法测定铁5332.2104 Lmol-1cm-1S=55.85/(2.2104)0.0025 gcm-2,

20、用双硫腙萃取光度法测定铜时，4.5104 Lmol-1cm-1，测定铅时，6.8104 Lmol-1cm-1，计算S。测CuS=63.55/(4.5104)0.0014 gcm-2测PbS=207.2/(6.8104)0.0030 gcm-2,例,影响准确度的因素,对比尔定律的偏离非单色光的影响化学反应的影响其他因素,光不纯引起的对Beer定律的偏离（1）,2,max,max,2,max处，基本不变2处，变化较大,A,A,/nm,c/mol/L,应尽量选择max作为测定波长（？）,光不纯引起的对Beer定律的偏离（2）,若1 2，则Abc 若1 2，则Abc 偏离朗伯比尔定律,两波长1,2的光

21、经溶液被吸收1处：A1lg(I0/It)=1bc，2处：A2lg(I0/It)=2bc，,I0=I0+I0,It=It+It,其他因素对比尔定律的影响,被测溶液的浓度太大，使得吸光质点太接近摩尔吸光系数发生变化溶液折光指数发生变化,化学因素引起对比尔定律的偏离,离解络合缔合,亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱a.6.3610-6 mol/Lb.1.2710-4 mol/Lc.5.9710-4 mol/L,亚甲蓝阳离子单体 max=660 nm二聚体 max=610 nm,8.4 显色反应与分析条件的选择,8.4.1 显色反应 反应条件的确定 测定中的干扰以及消除方法,显色剂,有机显色剂,丁二酮肟NN

22、型：CH3CCCH3 HON NOH,N,N,OH,COOH,SO,3,H,OO型：磺基水杨酸,ON型：,（PAR）,S型：,（双硫腙）,显色反应的选择,灵敏度高，一般104选择性好显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好,max60 nm.反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。显色条件易于控制，重现性好。,1)确定测定波长,A(380nm),A(350nm),K2Cr2O7的工作曲线与吸收曲线,0.4,0.0,0.8,0.0,0.4,0.8,350 380,/nm,c,c,2)确定显色剂用量（c(M)、pH一定）,c(R),c(R),c(R),3)确定显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）,pH

23、1pHpH2,pH,4)确定显色温度及显色时间(c(M)、c(R)、pH一定),另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等,邻二氮菲亚铁反应完全度与pH的关系（1）,Fe2+3R FeR3 31021.3c(R)R=10-4molL-1,3,H,H,A,柠檬酸,邻二氮菲亚铁反应完全度与pH的关系（2）,5)消除干扰(化学法）,Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+,CoR,ZnR NiR,FeR,CoR,Zn2+,Ni2+,Fe2+,钴试剂R,H+,测Co2:(生成络合物性质不同),消除干扰，也可采取分离法。,消除干扰（物理法）,-选择适当的测定波长,515,655,415,500,钍-偶氮砷

24、III,钴-亚硝基红盐,A,A,络合物,络合物,试剂,试剂,8.5 吸光光度法的应用8.5.1 单一组分测定8.5.2 多组分的测定8.5.4 光度滴定 双波长分光光度法 导数分光光度法 络合物组成的测定 酸碱离解常数的测定,多组分的测定,在1处测组分x,在2处测组分y在1处测组分xx,y组分不能直接测定A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1处测得A1)A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2处测得A2)xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y标液 在1,2处分别测得,光度滴定,典型的光度滴定曲线,依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。,双波长分光光度计示意图,双波长

25、增敏法测钴(显色剂5-Cl-PADAB),显色剂作参比,络合物增加,A=A2-(-A1)灵敏度提高,A,双波长增敏法测钴(显色剂5-Cl-PADAB),双波长分光光度法消除干扰示意图,在2，A2=Ax2+Ay2在1，A1=Ax1+Ay1,A=A2-A1=Ax2+Ay2(Ax1+Ay1)=Ax2 Ax1=Ax,Ay2 Ay1,Ax=(x2 x1)bcx消除了Y干扰,270nm,X苯酚Y2,4,6三氯苯酚,双波长分光光度法消除浑浊背景的干扰,A,2,1,y,Ax2,Ax1,Ay1,Ay2,A=Ax2 Ax1 与背景无关,导数分光光度法,A图,混合物导数光谱,0,1,2,3,4,紫外导数光谱检测法,

26、肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取 谭家镒 中国刑警学院法化系，沈阳 分析化学97.10审稿方法：肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用6的HClO4稀释，然后用GDX100大孔树脂萃取，用二氯甲烷5mL洗脱杀鼠剂，40挥干，剩余物用0.1molL-1NaOH4mL溶解后，紫外导数光谱测定。,紫外导数光谱检测法,空白肝普通光谱2.5 mg/L敌鼠溶液的普通光谱空白肝二阶导数光谱2.5 mg/L敌鼠溶液的二阶导数光谱,络合物组成的测定摩尔比法,固定cM,M+R MR,络合物组成的测定-连续变化法,一元弱酸离解常数的测定 p330,HL HL（HL、L颜色不同）,KaH+L/HL,高酸度下，几乎全部以HL存

27、在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以L存在，可测得AL Lc(HL).代入整理：,HL,L,或,MO离解常数的测定(1),MO吸收曲线,基础分析化学实验,p322,MO离解常数的测定(2),AHL,3.32(pKa),1,2,3,4,5,6,A,pH=pKa,pH,0.6,0.4,0.2,0,-0.2,-0.4,-0.6,3.0,4.0,pH,AL,3.32,请同学们下周一带书：仪器分析教程,8.6 紫外可见分光光度法在有机 定性分析中的应用,8.6.1 有机化合物分子的电子跃迁和吸收带8.6.2 有机分子中的生色团与助色团8.6.3 有机化合物结构与吸收峰的关系8.6.4 溶

28、剂对吸收光谱的影响8.6.5 计算不饱和有机化合物UV吸收波长的 经验规则8.6.6 应用,有机化合物分子的电子跃迁和吸收带,HCHO,*n*n*,*跃迁（饱和烃类）,n*跃迁（含杂原子）,n*跃迁（带孤对电子的杂原子与其他键共轭）,*跃迁（不饱和烃类),电荷迁移跃迁（荷移光谱）,特点：谱带宽,吸收强度大,max处的可大于104。,Fe3SCN-Fe2SCN,（分子内氧化还原）,h,R,h,DA,DA-,e给予体,e接受体,e给予体,e接受体,生色团类型,严格地说，只有含有不饱和基团或孤对电子的基团，才是生色团（*，n*）,CN，CCl：,CO，CS,n*，*,n*,*200nm,生色团 Ch

29、romophoric Group1,221000,275190,(CH3)2C=O,12.51000,289182,蒸气,H3CCHO,CO,4500,172,蒸气,C2H2,C三C,15530,171,气态,C2H4,CC,125,CH4,CH,135,C2H6,CC,max,溶剂,例,生色团,生色团 Chromophoric Group2,max,溶剂,例,生色团,15.84400,279202,己烷,CH3NO2,NO2,160,295,MeOH,乙酰胺,CONH2,60,204,水,乙酸乙酯,COOR,34,240,庚烷,CH3COCl,COCl,41,200,EtOH,CH3COOH

30、,COOH,200,COH，CSHCN，CCl,生色团 Chromophoric Group3,例：CH3Cl CH3Br CH3Imax(nm)172 204 258,助色团 Auxochromic Group 1,常见助色团及其助色效应(红移)FCH3ClBrOHOCH3NH2NHCH3 N(CH3)2 NHC6H5O,助色团 Auxochromic Group 2,不饱和基团助色效应大,B带max(nm)282 320,276(K带),B带max(nm)256 261 264,反助色团 Hypsochromic Group,大多是吸电子基团（蓝移）NH3SO2NH2COOCNCOOHCO

31、OCH3 COCH3 CHO,共轭烯烃键数与能量的关系 1,共轭烯烃键数与能量的关系 2,共轭烯烃键数与能量的关系 3,苯吸收带（溶剂：异辛烷）,精细结构B带(III),K带(II,E2),E带(I,E1),max,苯吸收带名称,苯环共轭的影响,苯的同系物的吸收光谱,苯环取代基的影响,C,N,(,C,H,3,),2,C,l,-,(,C,H,3,),2,N,+,羰基化合物,E,n,*,n*290 nm,*210 nm,n,*4,1,n*321 nm,*217 nm,2,*3,脂肪醛的*n*,2-丁烯醛的 2*3 n*3,溶剂对吸收光谱的影响,对称四嗪的吸收光谱,蒸气状态环己烷中水中,苯酚的UV吸

32、收的溶剂效应,pH对苯胺UV吸收的影响,苯胺 pKb=9.3,苯酚 pKa=9.95,/nm,苯胺UV吸收光谱图,H,O,C,O,H,C,O,O,-,-,O,C,C,O,O,-,O,+H,+OH,酸碱性导致物质结构发生变化,例：PP,sp3,sp2,（无色）,（红色）,溶剂极性对吸收光谱的影响 1,溶剂极性增大，n*吸收蓝移,例 丙酮,丙酮的UV吸收光谱图,溶剂效应（形成氢键）,无溶剂效应,E1,E2,水,乙醇,己烷,A,溶剂极性对吸收光谱的影响 2,溶剂效应,无溶剂效应,E1,E2,溶剂极性增大，*吸收红移,CH3,例：异亚丙基丙酮,异亚丙基丙酮,max,max,常用溶剂的光学透明区,大于以

33、上波长时使用,对溶剂的要求1.低极性 2.易溶解被测物3.稳定 4.在样品的吸收光谱区无明显吸收,定性分析,常用工具书,Sadtler Standard SpectraHeyden,London,197846000种化合物的紫外光谱Ultraviolet Spectra of Aromatic Compounds R.A.Friedel，Wiley,New York,1951579种芳香族化合物,结合红外，核磁，质谱 定性,同分异构体的判断,酮式在极性溶剂中,烯醇式在非极性溶剂中(正己烷),乙酰乙酸乙酯,?,243,己烷中*,204*,272 n*,水中,(nm),250,300,200,A,

34、乙醇中,乙酰乙酸乙酯的紫外吸收光谱,顺反异构体的判断,反式1,2-二苯乙烯max2952.7104,顺式1,2-二苯乙烯max2801.1104,顺反异构体的判断,反式肉桂酸max2957000,顺式肉桂酸max2801.35104,I-乙醚中 max300*（分子内氢键）II-水中 max250*,苯乙酰丙酮在乙醚(I),水中(II)的紫外光谱,CCH2CCH3,CCHCCH3,O,O,O,OH,酮式,烯醇式,苯乙酰丙酮,（与水分子间的氢键）,分子荧光(Fluorescence)分析分子磷光(Phosphorescence)分析,8.7 分子荧光和分子磷光分析法,8.7.1 荧光激发(吸收)

35、光谱，荧光(发射)光谱，磷光光谱8.7.2 荧光强度与物质浓度间的关系8.7.3 荧光与分子结构的关系8.7.4 影响荧光强度的主要因素8.7.5 荧光光度计及荧光测定方法8.7.6 荧光分析法的特点及应用8.7.7 磷光分析法,1575年，西班牙医生N.Monardes发现。1852年，Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。1867年，首次用于分析测定。1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。1952年，商品荧光分光光度计出现。,含有n和电子的分子的几种能态,发光机理（Jablonski Diagram）,荧光寿命109107 s,磷光寿命10410 s,蒽的

36、激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱）,激发光谱 Excitation Spectrum,发射光谱 Emission Spectrum,色氨酸的激发光谱、荧光光谱和磷光光谱,南大p252,荧光分析法测定血清中的镁,镁-Oxine的激发光谱和发射光谱,/,基础分析化学实验,p331,定量分析的基础-荧光强度(F)与物质浓度(c)的关系,在稀溶液中：F2.3bcI02.3AI0 荧光物质的荧光效率(量子产率)：荧光物质的吸光系数 b液层厚度 I0入射光强度当b，I0一定时：FKc,高浓度时，荧光物质发生自熄灭和自吸收现象使F与c不呈线性关系,一般当bc0.05 时,F与c呈线性关系,荧光与分子

37、结构的关系（1）,荧光黄,苯并芘,共轭双键体系越大,越易产生荧光,荧光与分子结构的关系（2）,酚酞（无荧光),8羟基喹啉（弱荧光),荧光黄,红色荧光,刚性平面结构分子有利于产生荧光 1,荧光与分子结构的关系（3）,滂铬蓝黑R（无荧光),红色荧光,联二苯 0.2,芴 1.0,刚性平面结构分子有利于产生荧光 2,给电子基增强荧光：OH,OR,NH2,NHR,NR2,CN等吸电子基减弱荧光：COOH,C=O,NO2,NN,Cl,Br,I等与体系作用小的取代基影响不明显：SO3R,NH3,SH,F,R,芳香族化合物苯环上取代基的影响（1）,水杨酸,取代基之间若生成氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光。

38、,芳香族化合物苯环上取代基的影响（2）,浓度：稀溶液，Fc(bc0.05)光源：应强度大，稳定。酸度：温度：t 低，增加。,影响荧光强度的主要因素,pH1,有荧光,pH13,无荧光,有荧光,无荧光,荧光光度计示意图,F,光电倍增管,F,荧光分光光度计光路图,荧光光度计光路图,可见紫外光度计光路图,Perkin-Elmer LS50 Fluorimeter.,Perkin-Elmer LS50 样品腔,荧光光度法的应用（1）,8羟基喹啉(Al,Be等),茜素紫酱R(Al,F-等),黄酮醇(Zr,Sn等),安息香(B,Zn,Ge,Si等),用于测定无机离子的有机试剂,定量方法-标准工作曲线法,确定

39、测定波长 ex，em；用标样，在选定的ex，em下测F，做工作曲线；测未知样F，根据工作曲线计算浓度。,荧光分析法的特点,灵敏度高：测定下限0.10.001 g/mL,比分光光度法高24个数量级。相对灵敏度:以喹啉硫酸氢盐的0.05mol/LH2SO4溶液(em 450nm）为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光物质的荧光强度进行比较。选择性高。,荧光测定的选择性,蒽的激发和发射光谱,菲和蒽的荧光光谱（激发波长 265 nm),菲在360 nm以上无吸收，用365 nm激发光时，菲无荧光，可以在400 nm测定蒽的荧光。在265 nm,蒽和菲均有吸收，以此波长的光激发，在350nm只有菲有荧光，

40、故可测定菲。,荧光光度法的应用（1）,生物化学分析，生理医学研究，临床检测直接测定能产生荧光的物质。如带苯环的氨基酸：色氨酸，酪氨酸，苯基丙氨酸。测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质。荧光熄灭法测定猝灭剂Ni2+对AlPAN络合物有荧光猝灭作用，可测Ni2+610-5 610-3 g/mL,测定举例:以H2SO4为溶剂，吸收苯并芘。萃取浓缩层析荧光分析荧光测定：ex=520 nmem=545 nm,荧光光度法的应用（2）,苯并芘,磷光分析法的应用,获得较强磷光应采取的措施：低温，固体磷光，分子缔合物的形成重原子效应(Ag+,Pb2+,Tl+盐类)磷光分析仪器液槽：低温时测磷光，石英液槽放入盛液氮 的石英杜瓦瓶中。斩波片：在激发光单色器与液槽之间，以及在 发射光单色器与液槽之间各装一个斩波片。应用：主要用于有机分析。,