分子诊断学-绪论感染性疾病的分子诊断.ppt

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1、绪论 Introduction,整体水平,细胞水平,分子水平,Chapter 6 核酸的分离与纯化Chapter 7 重组DNA技术Chapter 8 临床基因扩增检验技术Chapter 9 核酸分子杂交技术,Chapter 10 核酸测序技术Chapter 11 生物芯片技术Chapter 12 基因变异检测技术、脉冲电场凝胶电泳、分子影像Chapter 13 生物信息学在分子诊断中的应用,Section 1 分子诊断学的性质、任务和特点,分子诊断学(molecular diagnostics)，利用分子生物学技术研究机体外源和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而为

2、疾病的防治提供分子水平信息。,分子诊断学的任务,阐明疾病发生、发展的分子机制；分子诊断指标；建立检测方法,分子诊断学的特点,属于病因学诊断，特异性高；对某些基因变异做出判断；有更好的发展前景,Section 2 分子诊断学的历史、现状和未来,疾病基因突变谱，尤其是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)图谱的建立，为分子诊断提供了强有力的工具。,基础篇内容,Chapter 1 基因组 GenomeChapter 2 原核生物基因组ProkaryoticChapter 3 真核生物基因组EukaryoticChapter 4 病毒基因组 VirusC

3、hapter 5 蛋白质组学 Proteomics,技术篇内容,Chapter 14 感染性疾病的分子诊断,Key PointsMolecular diagnosis of infection disease means to estimate a disease through detecting the existence of gene of pathogenies directly,which is a relatively simple,rapid,specific and sensitive strategy of diagnosis.pathogeny：病原，发病机理,There

4、 are two main kinds of molecular techniques which are used to molecular diagnosis of infection disease,amplifying DNA probe signals and amplifying target DNA fragment.amplify：放大；probe：探针,3.Associated with conventional diagnosis methods,molecular diagnosis can be used to diagnose infection disease in

5、duced by virus,bacteria,leptospira螺旋体,chlamydia衣原体,mycoplasma支原体 and rickettsia立克次体,etc.,4.Compared with other conventional diagnosis methods,molecular diagnosis has many advantages in early diagnosing infection disease,identifying the genotype of pathogenies,detecting drug resistance gene,epidemiol

6、ogic investigating and supplying reliable evidence for clinical diagnosis and treatment.,感染性疾病的分子诊断主要是针对侵入人体内的病原体基因进行检测。不同的病原体有各自的种属特异的基因。前人铺路，后人受益,Section 1 总论一、感染性疾病分子诊断的策略,一般性检出策略：只需要提供是否有某种病原体的感染通过探针或扩增技术直接检出病原微生物的DNA/RNA，判断有无感染或何种感染,2.完整检出策略：不仅对病原体做出判断，还要进行分型（包括亚型）和耐药性方面的检测。思路：诊断分型亚型耐药性检测,二、感染性

7、疾病分子诊断的常用方法,信号放大检测技术方法 不涉及靶分子扩增，采用多酶、多探针或二者结合等方式增加探针标记物的浓度从而使信号得到放大，提高检测的灵敏度。如：液相杂交、杂交捕获及支链DNA（bDNA）等特点 美国FDA批准的商业试剂盒 感染因素少，无扩增所产生的污染 稳定性、重复性和特异性都较高，结果准确 放大倍数少，灵敏度较低,2.靶分子扩增技术检测方法 即方法中包含靶分子（DNA、RNA或探针）的扩增过程的技术。如PCR及衍生的扩增技术、连接酶链反应（LCR）、替代的扩增方法（TAS/SDA/NASBA等）特点 我国所售的商业试剂盒 简便、快速、灵敏度高 存在扩增所带来的污染问题,三、感染

8、性疾病分子诊断的标本处理,标本的选择标本量及抗凝剂标本的传送、保存标本的预处理,标本的选择与传统一样，标本的选择要符合疾病的发病机制，能反映病程的状态。由于检测方法的高灵敏性，可适当考虑标本采集的便利性和通用性。由于核酸样本的稳定性，可选用福尔马林及石蜡包埋固定的组织标本。核酸的选择对疾病的判断也很重要。什么时候用DNA？什么时候用mRNA?,标本量及抗凝剂少量标本：100ul-500ul不等，至多1ml。不同的检测方法，所需的标本量不一样。抗凝剂：EDTA、柠檬酸、草酸盐、肝素。肝素对转录酶和聚合酶有抑制作用，因此，基于PCR的检测方法一般不用肝素抗凝。,标本的传送、保存根据标本的种类和检测

9、目的，建立合理的运送体系。保证核酸完整性，防止标本相互间的交叉污染。,标本的预处理核酸的提取(DNA提取、RNA提取)扩增抑制物的去除危险病原体的灭活,四、感染性疾病分子诊断的结果解释,解释应包括病原体的生物学、病理学特征、实验技术的优点及局限性。阴性结果阳性结果定性检测结果疾病状况的判断,阴性结果解释检查质控是否正常。检查检测灵敏度、核酸提取量及扩增效率是否正常。引起假阴性的因素：样品量不足、标本类型不恰当、收集时间不符合要求、运输过程中样本降解。,阳性结果解释检测质控是否正常。注意检测的特异性和可能受到的污染等情况。产生假阳性的因素：引物探针的特异性、样本在采集、运送和处理等不同环节中的交

10、叉污染问题。,定性检测结果解释考虑定性检测的局限性考虑特定情况下，核酸样本的稳定性和不易降解性。,疾病状况的判断病原体存在与患病之间的相关关系为正确判断疾病应：选择具有代表性的标本，采用具有说服力的检测方法，建立适量的临界值。,五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价,弥补血清学检测技术的缺陷检测不能培养或生长缓慢的病原微生物通过病原体的定量检测监测疾病微生物耐药性的检测细菌分型及流行病学的调查,Section 2 病毒的基因检测,SARS相关冠状病毒的分子诊断,2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50 例SARS病人的临床表现和病毒学研究结果。一种新的冠状病毒(Coronavirus

11、)是SARS 的致病原因。(Lancet,2003,361:9365),2003年4月，德国汉堡Bernhard-Nocht热带医学研究所学者Drosten等用随机扩增技术，获得一段长度为300bp的核苷酸序列。根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的常规和实时定量PCR技术。(.org on April 10,2003）,检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、血浆、粪便。检测方法 1.逆转录-巢式PCR(Reverse-Nested PCR)2.逆转录-实时PCR(Reverse-Real time PCR),有报道显示，在可能SARS病人中病毒的检出率为100%。在疑似SARS病人

12、中的检出率为23%。所有健康接触者中未检测到病毒。,另一项研究显示 检测病毒的3种方法（血清学检测、病毒分离、PCR技术）中，PCR技术的检出率最高。,讨论,疾病的早期即可获得阳性结果(早于血清转换期）。SARS患者中的阳性率约为80%，对照中的阴性率约为98%100%。现有的PCR方法有较高的特异性但灵敏度较差，阴性结果不能排除病毒感染。,痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道排放是主要传播途径。血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒复制不仅发生于呼吸道。病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪便可能也是一种传播途径。鼻、咽子中含有的病毒RNA显著少于痰液，提示不适合作为标本（有可

13、能漏检）。,SARS相关冠状病毒基因检测必须注意的问题,必须在规范的基因扩增实验室中进行。应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。阳性结果时必须对原始样本重复检验：或者扩增另一个基因片段 或在另一个实验室对同一样本进行检测。,肝炎病毒基因的检测(hepatitis B virus,HBV),乙肝病毒基因组中有4个ORF，分别称为S、C、P和X。S区编码HBV的包膜蛋白，C区编码含HBeAg和HBcAg的多肽，P区编码依赖RNA的DNA聚合酶。必须经过逆转录复制过程，该病毒编码的RNA-DNA polymerase缺乏校正功能导致变异率较高,临床价值主要体现在：病情评估 血清中病毒含量的多

14、少与肝脏病理损害程度相关，病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。疗效预测 治疗前病毒核酸载量越高，疗效越差；载量越低，机体清除病毒的可能性越大。,预后判断病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。垂直传播途径感染者，预后较差。反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸水平经常波动者更易发展为肝硬化。,病毒分型和耐药检测各个编码区段存在着大量有意义的自然变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异株，从而导致HBV感染的不同血清学和临床表现。检测HBV的变异株对了解疾病机制、药物耐受和指导用药有一定的价值。参考ATCC HepG2 Cell Culture,HPV基因的检测在预防宫颈癌中的作用人乳头瘤病

15、毒(human papillomavirus,HPV),宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有50万左右新发病例。我国每年有新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的26%。,持续的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素，93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPV DNA。高危型HPV-16和HPV-18分别占宫颈癌的50%和14%。高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险增加250倍。,HPV DNA的检测方法实时定量PCR(Real time PCR)核酸杂交捕获（Hybrid

16、 CaptureII，HCII）,细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键,HIV基因的检测人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV),参考NSFC申请材料,单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV),巨细胞病毒(cytomegalovirus virus,CMV),Section 3 病原菌的基因检测,结合分歧杆菌的基因检测,结核分歧杆菌MTb，俗称结核杆菌TB，是结核病的致病菌。带病菌的痰液是TB

17、主要的传染源。MTbH37Rv基因组结构：环状双链DNA，共4 411 529kb，富含重复序列尤其是插入序列、多基因的家族序列及重复的管家基因序列。,TB分子诊断方法1,临床标本处理：标本：痰、胸腹腔积液、血清、尿液、脑脊液处理：液化剂去除粘蛋白，若带血则用红细胞裂解液去除血红蛋白，提取DNA,TB分子诊断方法2,常用的是靶分子扩增方法：直接PCR法、SDA法、LCR法扩增片段：抗原蛋白编码基因-165bp、MBP64-240bp、IS6 110-123bp、IS986-245bp、16S DNA-584bpTB的种属鉴定：以16S rRNA为靶基因美国FDA：Amplicor检测和MTD检测,TB分子诊断方法3,耐药性检测耐药性分子基础：利福平是抗结核治疗的关键药物。耐药的分子基础是RNA聚合酶的突变，主要集中在rpoB基因的81bp区域。耐药性鉴定：PCR-SSCP法和点突变的检测法,金黄色葡萄球菌幽门螺杆菌O157型大肠埃希菌淋病奈瑟菌,