分子生物学检测实验室技术要求与质量控制教学课件.ppt

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1、分子生物学检测实验室技术要求与质量控制,国家质检总局动植物检疫实验所二OO四年六月,实验室技术要求,总体要求质量控制质量保证,实验室总体要求,实验室分区要求实验室工作人员要求安全防护废弃物处理结果判断与验证,实验室分区要求设施和环境要求,各工作区域设置缓冲间，缓冲间的压力为负压（或上设抽风装置），与其相连的工作间为正压，工作间与缓冲间之间宜安装磁性连锁装置。不同功能的核酸检验工作区应是分隔独立的工作室，并有明显的标志，各区间不能直通。各区之间如果是紧密相连，需安装物品传递舱。每个工作区域的顶部应安装紫外灯，紫外灯的波长为254 nm，安装数量为每20 m2安装一支40W的紫外灯，灯与地面的距离

2、不宜超过（2.00.1）m。,实验室分区要求 工作区域的设置及要求,核酸检验区 试剂贮存和准备区;样品制备区;核酸制备区 扩增区;扩增产物分析区蛋白质检验区 蛋白质分离纯化区 蛋白质检测区其它区域 设置洗涤消毒室（洗涤、消毒、制备纯水和/或双蒸水、制冰等）、高速/超高速离心机室、低温/超低温冰箱室等。,主要功能：原装试剂和配制试剂的贮存，所有试剂的配制与分装。工作区域的压力要求：未设缓冲间的试剂贮存和准备区，工作区域为正压。注意事项：当试剂经质检合格后，应将其分装贮存备用，贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数决定。用于扩增的试剂应冰冻贮存。,核酸检验区各区功能 试剂贮存

3、和准备区,核酸检验区各区功能 样品制备区,主要功能：实验室样品的混样和测试样品的制备。工作区域的压力要求：未设缓冲间的样品制备区，工作区域为负压或减压，可安装排风系统。注意事项：此区应远离其它实验操作区；粉碎样品时的器皿应单独使用，所用的器具在使用前应经过彻底清洗并高压消毒，防止交叉污染；称取的测试样品应加盖后再移至样品核酸制备区。,核酸检验区各区功能 核酸制备区,主要功能：核酸的提取纯化与贮存；核酸含量的测定；测试样品DNA的保存。工作区域的压力要求：未设缓冲间的核酸制备区，工作区域为负压或减压，可安装排风系统。注意事项：已纯化的核酸应保存于20或80，避免反复冻融；阳性和阴性标准物质DNA

4、可调整至常用的使用浓度后分装并冷冻保存。,核酸检验区各区功能 扩增区,主要功能：PCR扩增反应体系的配制和模板的加入，核酸扩增。工作区域的压力要求：未设缓冲间的扩增区，工作区域为负压或减压，可安装排风系统。注意事项：严格限制无关人员出入并减少在本区内走动；加样应在超净工作台（生物安全柜）内进行，超净工作台的气流方向宜选择垂流式；巢式PCR的第二次加样必须在此区进行。,核酸检验区各区功能 扩增产物分析区,主要功能：扩增产物的测定工作区域的压力要求：未设缓冲间的扩增产物区，工作区域为负压或减压，应安装排风系统。注意事项：此区是最主要的扩增产物污染来源，应远离其它实验操作区；使用PCR-ELISA方

5、法检测扩增产物时，应使用洗板机洗板。若实验仅采用全自动扩增检测仪（如实时荧光定量PCR仪），可将扩增区与扩增产物分析区合并为一个区。,蛋白质检验区 功能及要求,蛋白质分离纯化区主要功能：用于蛋白质的分离与纯化。工作区域要求：蛋白质纯化应具备低温工作的场地，如4冷房和/或层析柜等。蛋白质分离纯化区主要功能：蛋白质分析检测,检测工作流程,实验室样品到样验收（确定是否具备检验的基本条件）混样获取测试样品测试样品的制备（待检状态）核酸和/或蛋白等目标物质的提取 PCR实验（包括扩增和产物分析）和/或蛋白质检测结果判定结果表述（出具检验报告）,实验室质量控制和质量保证工作人员操作要求,按照ISO/IEC

6、 17025：1999中5.2的要求。应具备良好的分子生物学专业技术操作规范。方向：试剂贮存和准备区样本制备区核酸制备区扩增区扩增产物分析区,各实验区域应有专用的仪器设备，同一区域内的仪器设备、物品和工作服应有明显标记，避免与其他区域的仪器设备混用。仪器设备的校准应符合ISO/IEC 17025：1999中5.5的规定。,实验室质量控制和质量保证仪器设备要求,实验室质量控制和质量保证试剂要求,除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。试剂的选购、验收、贮存应符合ISO/IEC 17025：1999规定。实验用水应符合GB 6682-92中一级水的规格。去

7、离子水的电阻应达到18.2。商品试剂盒应注明到货日期，对所收到的试剂盒应按规定的贮存条件存放。对菌种、质粒、动植物细胞组织的贮存与保管应符合ASTM E 1342-97的规定。,实验室质量控制和质量保证试剂配制,实验室配制的试剂应在容器上标明试剂名称、浓度、配制时间、保存条件、失效日期及配制者姓名。所用试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后高压灭菌保存，不宜高压灭菌的试剂应过滤（0.22 m）除菌；PCR主混液、引物、探针应避免反复冻融。,实验室质量控制和质量保证试剂配制,实验室应确定关键试剂，并在使用前进行质量检测。关键试剂包括：核酸提取试剂、RNase、蛋白酶K、阴性对照标准物质、阳性对照标准

8、物质、Taq酶、各种限制性内切酶、引物、探针、菌种、阳性质粒。试剂质检包括有无污染，是否存在假阳性；使用弱阳性对照标准物质检测试剂的扩增效果。,实验室质量控制和质量保证 防止污染,严格实验室分区对实验室进行功能分区，各区的工作服、实验用具和实验记录本应区分标记，不能混用。样品管理送检样品的包装应完好并有明确的标识；在对实验室样品进行混样、测试样品的制备和称量过程中应避免交叉污染。实验过程的质量控制,实验室质量控制和质量保证 实验过程的质量控制,实验室环境对照 阴性质控对照 核酸提取空白对照：核酸提取过程中不加样品的空白管；PCR试剂对照：不含DNA/cDNA模板的PCR扩增反应液试剂；阴性目标

9、DNA对照：即为内源基因对照，与测试样品等同处理。阳性质控对照 检验PCR反应是否正常进行 PCR抑制物对照 检测PCR反应体系中是否存在水溶性抑制物质。当PCR反应无扩增结果和定量PCR时宜设此对照。,实验室质量控制和质量保证 避免各类实验污染,避免扩增产物污染 PCR扩增反应液中加入UDG酶，以dUTP代替dTTP可防止以前PCR扩增产物所致的遗留污染。避免RNase污染（RNA检测）戴口罩和手套;DEPC;高温烘烤;RNase抑制剂 避免操作过程污染 实时荧光PCR和总核酸杂交法可防止操作过程的污染，实时荧光PCR尤其转基因产品检测实验室重要的防污染措施之一。,阳性样品,阴性样品,Ct

10、值,转基因马铃薯和油菜籽的实时荧光PCR检测,实验室质量控制和质量保证室间质量评价测试,凡对外开展基因检测并出具检测报告的实验室，应定期参加国家有关法定部门组织的检验项目的室间质量评价测试。,实验室质量控制和质量保证 实验室清洁,清洁方向 应按检测工作流程方向进行：试剂贮存和准备区样品粉碎区核酸制备区扩增区产物分析区 清洁用具 不同实验区域的清洁用具应固定，不能交叉使用。工作结束后应立即对工作区域进行清洁。,实验室质量控制和质量保证 实验室清洁,实验室空间 实验室空间应定期进行紫外照射。实验台面和仪器设备的清洁 实验台面、超净工作台宜用3%双氧水或10%次氯酸钠溶液（含有效氯1 g/L）擦拭清

11、洁；也可在擦拭后再用紫外光照射，照射距离应不超过90 cm，照射时间宜过夜。注：10%次氯酸钠和3%双氧水应在使用前配制，配制好的溶液不宜长期存放。,实验室质量控制和质量保证 有毒有害及废弃物质的处理,移液器吸头 使用过的移液器吸头应放入含有10%次氯酸钠溶液的容器内浸泡，浸泡时间不宜少于24 h。PCR产物 含有PCR产物的所有液体及废弃物应放入含有1 mol/L HCl的容器中浸泡，浸泡时间不宜少于6 h；采用PCR-ELISA方法检测时洗板机洗板所产生的废液应收集至1 mol/L HCl溶液中。琼脂糖凝胶及电泳液 对含有EB或经EB浸泡过的琼脂糖凝胶、电泳缓冲液的处理参见分子克隆。阳性样

12、品和质粒 阳性质粒宜放入1 mol/L HCl溶液中浸泡，浸泡时间不宜少于6 h。,实验室质量控制和质量保证 安全防护,紫外线应佩戴具有紫外线防护功能的护目镜和/或防护面罩，并遮蔽暴露的皮肤。紫外照射消毒后由于空气中臭氧富集，不宜立即开始工作，应在停止紫外照射30 min后开始工作，有条件的实验室，可安装无臭氧紫外灯。溴化乙锭 在接触溴化乙锭时应戴一次性腈类手套，实验操作宜固定在一定的区间、使用相对固定的容器。放射线在做有放射性物质的实验操作时应遵照GB 11930-89中的规定进行个人防护。细菌培养物细菌培养物及所接触的平皿应在121、30 min消毒后方可丢弃。,实验室质量控制和质量保证 结果判断,假阳性结果 内标基因，阴性对照假阴性结果 内标基因，阳性对照定量结果 重复性实验，操作规范。,