分子生物学提要.ppt

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1、必须稳定地含有关于有机体细胞结构、功能、发育和繁殖的各种信息必须能精确的复制，使后代具有与亲代细胞相同的信息必须能够变异，为生物的进化提供基础,遗传物质的基本特点,生物的遗传物质是DNA,Griffith，1928：肺炎双球菌转化实验 Avery，1943：体外转化实验 Hershey，1952：噬菌体转导实验,DNA双螺旋模型 1953 Watson/Crick 提出了DNA双螺旋结构模型；意义：对生命科学的发展作用可与达尔文学说媲美，与孟德尔定律齐名。从而使遗传学的研究全面进入分子遗传学阶段,确定了遗传信息的传递方式1961 年 Monod 和 Jacob 提出了操纵子学说；1964 年

2、Nirenberg 等提出了“三联体密码说”；Crick 提出了遗传信息流向和表达的中心法则这三大发现大大促进了生命科学的迅速发展，为基因工程的诞生奠定了重要的理论基础,右手螺旋：A-DNA、B-DNA、C-DNA、D-DNA左手螺旋：Z-DNA螺旋盘绕的松散程度受DNA分子的内力影响，DNA双螺旋结构永远处于动态平衡中，条件变化，B-DNA构象变化，可以形成A-DNA或C-DNA等。大沟和小沟是DNA行使功能时蛋白质的识别位点，构象发生变化，蛋白质对DNA分子的识别也发生相应变化,核酸分子中的回文序列,回文序列中的单链可形成发卡结构,双链回文序列可形成十字架结构,DNA超螺旋结构,超螺旋的意

3、义：紧密，体积更小；能影响双螺旋的解链程序，因而影响DNA分子与其它分子之间的相互作用。包括正超螺旋和负超螺旋，在一定条件下，可互相转变。双螺旋DNA的松开导致负超螺旋，而拧紧则导致正超螺旋。,超螺旋DNA的性质,结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。,变性,核内不均一RNA（hnRNA）真核细胞mRNA的原始转录物是分子量极大的前体，在核内加工过程中所形成的分子大小不一的中间产物。开放阅读框（open reading frame，ORF）mRNA分子上从起始密码子开始到终止密码子结束的一段连续的核苷酸序列，即mRNA分子上的编码区。,真核生物mRNA的结构3端具有polyA结构；5端具

4、有帽子结构；只有一个开放阅读框。原核生物mRNA的结构3端不具有polyA结构；具有一个或多个开放阅读框。,tRNA,tRNA的二级结构 aa接受臂（amino acid arm）二氢尿嘧啶环（DHU loop）反密码环（anticodon loop）额外环（extra loop）TC环（TC loop）,同功tRNA：识别同种氨基酸，但反密码子不同的多个tRNA。多数tRNA和少数tRNA：反密码子相同但结构不同的tRNA。副密码子：tRNA分子上决定其携带何种氨基酸的区域，能被AA-tRNA合成酶识别。,核酶（ribozyme）,核酶(Ribozyme)是一种具有核酸内切酶活性的反义RNA

5、分子，可特异性地切割靶RNA序列，具有解离后重复切割相同靶分子的能力。,核酶发现的意义,它突破了“酶是蛋白质”的传统概念。核酸性酶的发现对科学家们普遍感兴趣的生命的起源这一问题有了新的认识，对生物前化学（prebiotic chemistry）有重要贡献。,核酶的类型,剪切型核酶催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶。剪接型核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。,核酶的催化活性,核苷酸转移作用磷酸二酯键水解作用 磷酸转移反应催化作用 脱磷酸作用限制性内切酶作用,核酸的杂交,定义不同来源的、序列互补的单链RNA、DNA，或DNA和RNA，根据碱基互补原则，借助氢键连接为双链分子的过程。核酸

6、杂交类型单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA）单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA）单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）,核酸的变性,定义：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，但并不涉及共价键的断裂 变性方法：热变性、酸碱变性、化学变性剂 增色效应（hyperchromicity）由于DNA变性而引起的光吸收增加的现象 DNA的融点（或熔解温度，Tm）DNA分子的一半发生变性时的温度为Tm。DNA分子的变性是一个爆发过程，变性作用发生在一个很狭窄的温度范围（68），变性曲线为双曲线,核酸的复性,定义 指变性DNA分子在适当条件下，两条彼此分开的链自发重新缔合成为双螺旋结构复

7、性过程：成核作用；拉拉链作用 复性条件足够的盐浓度，0.150.50mol/L合适的温度：比Tm低2025 样品的性质DNA的浓度DNA片段的大小,核酸杂交技术（分子杂交）,分子杂交技术 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。分子杂交的目的就是运用特异性探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。,双链probe或DNA解链主要取决于：1链的长度：链越长，需要的 能量多才能解链；2碱基成分：GC含量高，较难变性；3化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链,核酸探针,核酸探针

8、 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。Probe可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。,探针的标记,将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的标识物同位素：32P,35S,3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。常用的标记方法缺口平移法随机引物法,探针来源,基因组探针从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。DNA克隆cDNA探针从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。寡核苷酸探针根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段。一般长约1550个bp。多数探针

9、的制备都通过分子克隆的方法获得。,缺口平移法（Nick Translation）,反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口处按5 3方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性，在缺口处3端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记的单核苷酸，随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。,随机引物法（6核苷酸引物标记法）,原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5 3聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引

10、物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3端为起点，沿模板3 5方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。,常用核酸分子杂交方法,Southern 印迹杂交法Northern 印迹杂交法斑点杂交或狭缝杂交法 菌落杂交夹心杂交法原位杂交,三种印迹技术的比较,核酸分子杂交（固相杂交）操作程序,制备待测核酸样品,分离、变性、转移、固化DNA片段,杂交,加入标记核酸探针,检测杂交信号,标记核酸探针,预杂交,制备核酸探针,漂洗去除未参与杂交的标记探针,基因芯片,基因芯片是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量DNA探针以点涂的方式有序地固化于支持

11、物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品的信号（即基因序列或表达的信息）突出特点：高度并行性、多样性、微型化、自动化,反义核酸,反义核酸（antisense nuleic acid）是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体自身合成的特定互补的DNA或RNA片段（或其化学修饰的衍生物），能够与目的序列结合，通过空间位阻效应或诱导RNase活性，在复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译等水平，抑制或封闭目的基因的表达,反义技术（antisense technology）,根据碱基互补原理，用人工合成或生物体自身合成的特定互补的DNA或RNA片段（或其化学修饰产物）抑制或封闭

12、目的基因的表达的技术。反义DNA反义RNA肽核酸,肽核酸(peptide nucleic acid,PNA),是指在特定肽链上连接不同碱基的核酸。即：以类氨基多肽链（N-氨基乙烷基乙酸链）代替核酸中的磷酸戊糖骨架，并按一定序列结合上标准的A、G、C、T碱基.第三代反义寡核苷酸药物作用 肽核酸可与互补DNA或RNA特异性结合，抑制或封闭基因表达。特点 与靶基因结合能力强，稳定性好，易吸收，在体内具有内切酶活性和抑制端粒作用。,反义核酸的有效抑制结合区,mRNA5端非翻译区mRNA5端编码区，主要是起始密码AUGmRNA5端帽子形成位点前体mRNA外显子和内含子结合部位mRNApolyA形成位点阻

13、止mRNA的成熟和向胞浆的转运,RNA干扰,RNAi：一条短小的单链RNA与一条mRNA的互补区发生碱基配对作用，从而阻遏这条mRNA的表达。即一种RNA能够有效地控制另一种RNA的活性。具有RNA干扰作用的RNA分子称为小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）.,RNAi 的机制,第一步（起始阶段）较长ds RNA在ATP参与下被RNase样的特异核酸酶(Dicer)切割加工成2123nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA。,RNAi 的机制,第二步（效应阶段）siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体（RI

14、SC）由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。,红色为正义RNA段蓝色为反义RNA段绿色为目标信使RNA；dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶mRNA水平，达到干扰目的,RNAi的效应,siRNA与靶mRNA形成的双链结构阻止其它蛋白因子与靶mRNA的结合；影响靶mRNA其它区域的空间结构的形成；形成的双链结构体区会成为双链RNA酶的作用靶标，使靶mRNA被降解

15、。,RNAi 的特点,转录后水平的基因沉默指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象 较高的特异性能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA 高效性相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制 可遗传性及远距离效应RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，传递给子一代,病毒核酸的一般特征,病毒核酸分子大小差别很大，3kb300kb。病毒核酸存在形式多样 如单链RNA，双链RNA，单链DNA，双链DNA；线状和环状两种。病毒核酸分正、负链病毒基因组具有操纵子结构噬菌体基因组中无内含子，但动物病毒的基因组中具有内含子。病毒基因组织有重叠基因的存

16、在。,端粒与端粒酶,端粒（telomere）真核细胞染色体末端的蛋白质-DNA复合体，是染色体必需的组成部分。大多数有机体的端粒DNA由非常短的串联重复DNA排列而成，富含鸟嘌呤。其序列多样，与功能没有直接联系。端粒DNA的平均长度因物种而异。人类的端粒序列为TTAGGGn，约520kb。，随着细胞的持续分裂，端粒会缓慢缩短.,端粒的功能,能封闭正常染色体末端，维持了染色体结构的完整性。保证遗传信息的完全复制。端粒使染色体具有极性，保证了染色体在细胞周期中的正常行为。在维持细胞核的三维结构及染色体配对中起一定的作用。端粒起到细胞分裂计时器的作用,端粒酶的化学性质是核糖核蛋白,是一种自身携带模板

17、的反转录酶，催化端粒DNA的合成，能够在缺少DNA模板的情况下,以自身携带的RNA为模板，逆转录合成端粒DNA并添加于染色体末端，从而维持了端粒长度的稳定。端粒酶RNA作为合成端粒DNA的模板；端粒酶蛋白亚基具有逆转录酶活性。,端粒酶（telomerase）,对人体正常组织、多种良性病变及恶性肿瘤组织端粒酶活性进行检测，发现细胞分裂能力较强，分裂较快的组织端粒酶活性较高。胎儿时期的端粒酶有较高的活性，但在出生后不久，除生殖细胞和干细胞等少数细胞显弱端粒酶活性外，均无端粒酶活性。但绝大多数恶性肿瘤组织均显示明显的端粒酶活性。,真核生物DNA,非重复序列（单拷贝序列）单拷贝或23个拷贝；编码蛋白质

18、和酶的基因，占6065；轻度重复序列 拷贝数：210个拷贝；包括组蛋白基因和tRNA基因。中度重复序列 拷贝数：10几百个拷贝；平均大小约300bp；一般不编码，认为在基因调控的开启、促进或终止转录、DNA复制的起始、其转录产物参与hnRNA的处理等方面起着重要作用。高度重复序列 拷贝数：几百几百万个拷贝；重复单位在数个bp至数千bp之间；包括rRNA基因和某些tRNA基因，卫星DNA等。,组蛋白,特点 分子量小（15 00020 000）；碱性蛋白质；含量高，每种分子数可达6 000万个；没有种属和组织专一性；类型 核小体组蛋白：H2A、H2B、H3、H4；H1组蛋白；功能 组蛋白分子中的正

19、电荷使组蛋白借静电引力与带负电荷的磷酸形成稳定的盐键，使组蛋白与DNA分子紧密结合。,非组蛋白,特点 酸性蛋白质；带负电荷；含量低，种类多（数百），每种仅1万个分子；具有种属和组织特异性类型一半是结构蛋白质；一半为酶类；如DNA聚合酶、RNA聚合酶等功能 为序列特异性DNA结合蛋白，能从DNA双链的大沟、小沟中识别特定的碱基排列并与碱基形成氢键，从而与一段较短的特异DNA序列结合。,重叠基因,病毒和噬菌体中，以有限的碱基编码更多的遗传信息。重叠类型异相位基因重叠 终止密码子与起始密码子重叠。同相位基因重叠 合成的多肽链仅长短不同，氨基酸序列相同。反相位基因重叠 DNA双链都有编码功能。,非组蛋

20、白具体功能,参与染色体的构建 即在核小体基础上将纤维进一步折叠、盘曲，以形成在复制和转录功能上相对独立的结构；启动基因的复制 以复合物的形式结合在一段特异DNA序列上，复合物包括启动蛋白、DNA聚合酶、引物酶等，启动和推进DNA分子的复制；调控基因的转录 非组蛋白作为基因调控蛋白以竞争或协同结合方式作用于一段特异DNA序列上，以调控有关基因的转录。,1.3.2 组蛋白和非组蛋白的磷酸化,真核生物组蛋白的共价修饰包括：乙酰化、甲基化、磷酸化。修饰作用的共同点降低组蛋白所携带的正电荷。修饰作用表现为周期性，提示可能与组蛋白功能的改变有关,Lys、Arg、His,Ser-OH,现代基因的概念,基因

21、是有功能的DNA片段，含有合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位。基因包括编码蛋白质肽链或RNA的编码序列以及保证其转录所必需的调控序列。,假基因,假基因：不能转录或转录后不能生成无功能的蛋白质的基因。,基因的结构,完整的基因：前导区、尾部区、内含子和外显子；前导区（leader）位于编码区的前面，相当于mRNA起始密码5端的序列；尾部区（trailer）位于编码区之后，指mRNA3端终止密码子后面的非翻译序列；内含子（intron）位于编码序列之间，通常指基因中能被转录成前体转录物，但却不能成为mRNA组成部分的区域；外显子（exon）即编码序列，也就

22、是DNA分子中编码mRNA某一部分序列的区域。,原核生物基因特征,功能相关的基因高度集中，构成操纵子；重复序列少；大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式；而RNA基因常是多拷贝的；没有内含子，基因是连续的；多顺反子，构成转录单位；绝大部分DNA都是用于编码蛋白质的，只有很少不编码的序列；基因组较小，1分子环状双链DNA。,真核生物基因特征,核基因组由染色体DNA组成：分子量较大；结构复杂；与蛋白质（组蛋白、非组蛋白）结合；多数都是断裂基因：即编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）间隔开；基因家族：起源相同、结构相似、功能相关的一组基因。大量重复序列（2060）：单一序列、轻度重复序列、中度重复序列

23、、高度重复序列；单顺反子；,断裂基因（splite gene）,高等真核生物中，内含子将编码序列分割为多个片段。内含子是相对的。一个基因中的内含子可能是另一个基因的外显子；有的内含子可编码。断裂基因的意义有利于储存较多的遗传信息；有利于变异和进化。,基因家族,分为编码RNA的（如snRNA、tRNA、rRNA等）和编码蛋白质的；基因簇：串联排列的基因；（组蛋白基因簇）分散分布的基因家族超基因家族：是由基因家族和单基因组成的较大的基因家族。,组蛋白基因家族rRNA基因家族,高度重复序列,反向重复序列 双链DNA分子中某一段序列，方向相反，序列相同，也称为回文序列。作用：可形成十字形发夹环结构与特

24、异的DNA结合蛋白相互作用；含有特异的限制性核酸内切酶识别序列。功能：可能与复制、转录的调控有关 卫星DNA 在蔗糖或氯化铯密度梯度超速离心中的浮力密度曲线图上位于DNA主带旁边的小带DNA。结构：串联重复序列，每个重复序列中含有一个短的保守的重复单位，称为核心序列。功能：染色体定位、染色体折叠压缩，染色体配对分离。,原癌基因和癌基因,原癌基因（proto-oncogene）为细胞的正常基因，多编码控制细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖的各种调控因子和活性蛋白，是细胞正常功能所必需；癌基因（oncogene）为原癌基因的突变形式，或改变了表达方式（过量、产物活性的改变，等），其结果是引起正常细胞的癌

25、变。原癌基因的激活与细胞生长和分化密切相关，原癌基因的激活受到严格的控制。,抑癌基因,抑癌基因（anti-oncogene）是正常细胞分裂、生长的负性调控基因，其编码的蛋白质抑制细胞增殖分裂。抑癌基因失活导致肿瘤的形成。基因水平上的缺失、插入、突变和重组；转录、转录后加工、翻译或蛋白质降解异常；蛋白质功能异常；,基因组,基因组是细胞中一套完整单体的遗传物质的总和。细菌、噬菌体中，即单个染色体上所含的全部基因。二倍体真核生物的基因组则是指维持配子或配子体正常功能的最基本的一套染色体及其所携带的全部基因。基因组结构主要指不同的DNA功能区在DNA分子中的分布和排列情况。基因组并非基因的随机组合，而

26、是功能性的高级结构。,C值和C值矛盾,C值(C value)一种物种的单倍体基因组的DNA总量C值是特异的。不同物种的C值差异极大。在真核生物中，C值一般随着生物的进化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。C值悖理 生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比例增加,构建基因组的遗传图谱构建基因组的物理图谱测定基因组DNA的全部序列；构建基因组的转录本图谱；分析基因组的功能。,基因组研究的重要任务,遗传图谱,遗传图谱（genetic map）即连锁图谱，以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。经典遗传标记 DNA分子遗传标记,DNA分子遗传标记,第一代DNA遗传标记限制性

27、片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）；第二代DNA遗传标记小卫星DNA（minisatellite DNA）、微卫星DNA（microsatellite DNA）；第三代DNA遗传标记单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism SNP）；,限制性片段长度多态性（RFLP）,原理 DNA序列上的微小变化，甚至1个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。优点 RFLP的出现频率远远超过了经典的蛋白质多态性。而且只要选择得当，生物体内出现共显性RFLP及RAP

28、D分子标记的频率较高。局限 一般只能产生限制酶切位点的“切开”和“不切开”两种情况，所提供的多态性信息量较小。进行RFLP分析时，既不安全又不易自动化。,小卫星DNA,小卫星DNA（minisatellite DNA）是指重复单位长度在1565个核苷酸左右的串联重复序列，一般长度不超过20kb。散布于人类各染色体的不同部位，其重复次数（即小卫星DNA区的长度）在人群中是高度变异的。同时又按照孟德尔规律遗传，所以是很好的DNA多态性标记，被广泛应用于基因定位、DNA指纹分析和遗传病的连锁诊断。,微卫星DNA,微卫星DNA（microsatellite DNA）是指重复单位长度在26个核苷酸之间的

29、串联重复序列。也称为简短串联重复序列。通常只重复1060次。人类基因组中已定位的微卫星DNA位点超过10 000处，因其重复次数在不同个体间呈高度变异性而被广泛应用于遗传分析和疾病诊断中。,单核苷酸多态性（SNP）,指基因组中核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。包括单碱基转换、颠换、插入/缺失等。SNP位点极其丰富，在人的基因组中，每1000bp就会有1个SNP。,物理图谱(physical map),定义 以一段已知核苷酸序列的DNA片段（序列标记位点sequence tagged site，STS）为路标，以Mb或kb为图距的基因组图。STS其实只是基因组中任何单拷贝的短DNA序列，

30、长度在100500bp之间。物理图谱是用物理学方法定位的由客观物组成的图谱。,物理图谱的构建,物理图的主要内容是建立相互重叠连接的“相连DNA片段群”。物理图谱是遗传图谱过渡到表达图谱的桥梁，物理图谱的最终形式就是碱基在染色体上的相对顺序。,基因图谱,即基因转录图（cDNA图），或者基因的cDNA片段图，也就是表达序列标签图。EST（expressed sequence tag）通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5或3端序列称为表达序列标签，一般长300-500bp左右。目标：鉴别全部基因，包括RNA基因，以及基因组中其它序列的结构和功能。转录图或基因表达谱研究所

31、提供的信息，使人们有可能系统、全面地从mRNA水平了解特定细胞,人类基因组计划（human genome project，HGP）,人类基因组即人类一个细胞所包含的DNA结构一整套基因，携带决定生物特性的全部遗传信息即记录基因组全部DNA序列。,“逐个克隆法”：对连续克隆系中排定的BAC 克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装(公共领域测序计划),“全基因组鸟枪法”：在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装(美国 Celera公司）,人类基因组计划：大规模测序基本策略,基本原理:通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可

32、在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。,链终止法测序(the chain termination method),Sanger,基因文库,基因文库(G-文库)：是含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。基因文库含有基因组内全部基因片段，包括外显子和无表达功能的内含子序列。每一个克隆只含有一个基因片段，应用时利用探针，从文库中钓取含有所需目的基因的克隆。,cDNA文库,cDNA文库(C-文库)：是以mRNA互补合成的cDNA的随机片段的重组DNA克隆群。cDNA文库不含内含子序列，易于表达。具有组织细胞特异性：不同组织细胞、不同发育阶段，

33、基因表达的情况都不相同，应选择特异表达的细胞及状态；C-文库比G-文库小得多，更容易筛选。,后基因组研究计划,“功能基因组学”是研究基因组中所有基因功能的学科。它在整体水平上研究一种组织或细胞在同一时间或同一条件下所表达的基因的种类、数量、功能及在基因组中的定位，或同一细胞在不同状态下基因表达的差异。主要内容 基因表达谱的研究 蛋白质产物的功能基因组多样性的研究 基因组功能注释,转座子,转座子（transposon，Tn）基因组中存在的能自主复制和位移的一些DNA序列。转座子的共同特点两端有反向重复序列（inverted terminal repeats，ITR，IR）；转座后靶位点重复序列是

34、正向重复（direct repeats，DR）；编码与转座有关的蛋白，例如转座酶；可以在基因组中移动；,转座子是基因组的正常组成成分，不以独立的形式存在（如噬菌体或质粒DNA）。转座的发生不依赖于转座子和靶位点之间任何的序列同源性，在基因组内由一个部位直接转移到另一个部位。转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是随机的，,转座子分类,按照作用过程分类 转座子 直接以DNA形式介导，遗传信息的移动是从DNA到DNA。逆转座子（返座子）由RNA介导，即遗传信息的移动是从DNA到RNA再到DNA。按照结构分类 简单型转座子复合型转座子,转座子A家族转座噬菌体,简单型转座子 不含任何宿主基因，常被称为

35、插入序列（insertional sequence）即IS序列，是可独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。复合型转座子带有某些宿主基因（如抗药性基因），其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。,转座子A家族,TnA家族包括几个相关的转座子，其中Tn3和Tn1000最具代表性结构特点比较大 5kb，两端不含IS，通常末端有38bp左右的IR，具有独立的转座酶和解离酶基因，含抗药性基因,基因组靶位点的交错断裂；转座子连接到单链末端，填补缺口；靶位点不具有特异性，但也有插入热点区域存在。,转座机制的共同特征,转座子产生的复制或非复制类型,复制型转座非复制型转座保守型转座,逆转录病毒基因组的结构与

36、功能,编码区：典型的反转录病毒含34个“基因”gag:internal structural protein 病毒核心蛋白基因pol:RNAdependent DNA polymerase 逆转录酶基因env:envelop glycoproteins 外膜糖蛋白基因,非编码区,R区：为基因组两端的重复序列，每个重复单位1080nt，cDNA()的反转录所必需的。PB:负链cDNA合成的起始位点，称为引物结合区可与各种tRNA的3端碱基互补U区U5 80-100nt(单一序列)U3 含1701260（或1350）nt，含有强的启动子，从这里开始合成前病毒DNA,质粒的遗传特性,双链闭合环状DN

37、A（cccDNA），1200kb；质粒复制有赖于宿主细胞的复制，但其自身基因可控制合成的时限及拷贝数；垂直传递；不影响宿主细胞的代谢，但可能赋予宿主细胞新的表型；质粒的复制方式 半保留复制；单向/双向；单向；双向；,质粒的遗传学类型,F质粒 性质粒。R质粒 耐药性质粒。Col质粒 含有合成大肠杆菌素基因的质粒；质粒噬菌体 由质粒DNA和噬菌体DNA重组形成的嵌合体。,根据复制特点，质粒分类,严紧型质粒（stringennt plasmid）其DNA复制与宿主染色体DNA的复制相偶联，依赖于蛋白质的合成，复制要求DNA聚合酶的存在；松弛型质粒（relax plasmid）其DNA复制与宿主染色体

38、DNA的复制不同步，且与蛋白质的合成功能无关；用DNA聚合酶复制，能在没有蛋白质合成的情况下继续复制；低拷贝质粒与高拷贝质粒,质粒的不相容性,质粒的不相容性指两种亲缘关系相近的质粒不能稳定地存在于同一个细胞中。不相容性是由于两种质粒中具有类似的阻遏物及质粒DNA随机复制而导致的结果。,接合型质粒质粒DNA中带有编码细菌配对和质粒转移的基因，可从一个细胞传递给另一个细胞；一般其分子量较大，多为严密型质粒。非接合型质粒不能在细胞间水平传播，但可以借助共同存在于宿主细胞中的接合型质粒，而发生迁移作用；一般其分子量较小，多为松弛型质粒。基因工程中，通常采用的是松弛型、非接合型质粒。,广义的遗传重组凡是

39、能产生新的基因组合，造成基因型变化的过程，都称为遗传重组。包括独立分配或交换；如减数分裂中的非同源染色体的自由组合。狭义的遗传重组专指涉及DNA分子内的断裂并重新连接而造成基因重新组合的过程，即基因交换。,遗传重组的类型,同源重组位点特异性重组转座作用异常重组,同源重组,同源重组是依赖大范围的DNA同源序列的联会。重组过程中，两个染色单体或DNA分子相互交换对等的部分，因此表现出交互的特点。同源重组中负责DNA配对和重组的蛋白质系统无碱基序列的特异性的要求，只要两条DNA序列表现出同源性(相同或接近)，重组就可以在此序列中的任何一点发生。重组热点:一些序列发生重组的频率高于其他序列,同源重组的

40、分子机制（Holliday模型）,四个关键步骤两个同源染色体DNA排列整齐；一个DNA的一条链断裂并与另一个DNA对应的链连接，形成的连接分子称为Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。,位点专一性重组,att位点为POP(240bp)BOB(23bp)整合过程需要整合酶（Int）寄主的整合宿主因子IHF,噬菌体的整合作用,裂解期和溶源化的DNA可以通过位点特异性重组相互转变（整合和切离）；噬菌体和宿主均有相应的附着点att，噬菌体DNA位点称为attP，宿主DNA位点称为attB。其中O序列在二者之间同源，是二者配对

41、及发生互换的区域。O序列全长15bp，富含A-T碱基对，无回文序列。,免疫球蛋白基因,属于3个基因家族，分别位于不同的染色体上两个轻链类型（Ig、Ig基因）一个重链类型（IgH基因）,抗体多样性产生的原因,通过从不同的基因片段中随机选择几个基因片段组合成不同的抗体。V（D）J重排是不精确的，可在连接位置两端的任何一端删除一些碱基或加上原来片段中没有的碱基。体细胞突变，当一个产生抗体的细胞克隆增殖时，正好遇到外来抗原，将产生抗体基因的突变。,重组信号和12/23规则,每个基因旁都有一个保守的回文结构七聚体5-CACAGTG-3；其旁是保守的九聚体5-ACAAAAACC-3。重排信号序列（reco

42、mbination signal sequences，RSSs）：指七聚体和九聚体之间的12个碱基或23个碱基序列。12/23规则保证轻链和重链的正确连接。12/23规则即重排信号序列的排列规则是12bp的信号序列总是与23bp个碱基的信号序列连接。,复制的忠实性,DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，错配率为7 10-6）DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5外切酶切除）起始时以RNA作为引物,DNA复制的酶系,解链有关的酶 DNA聚合酶类（DNA po

43、lymerase）引发酶DNA连接酶,解链有关的酶,解链酶解开DNA双链中氢键，消耗ATP解旋酶（helicase）Rep蛋白 单链结合蛋白（ssb）起稳定单链DNA的作用拓扑异构酶复制前拓扑异构酶切断DNA双链，松开正超螺旋，复制后重新使DNA双链连接，形成负超螺旋。,拓扑异构酶,拓扑异构酶在复制叉处消除解链过程中产生的超螺旋。拓扑异构酶切开一条链，释放超螺旋后，再连接封闭。拓扑异构酶同时切开两条链，再连接封闭。,原核细胞中的DNA聚合酶,pol 主要在DNA修复中起作用。多功能酶，活性包括：53DNA聚合酶活性；35核酸外切酶活性；（校正作用）53核酸外切酶活性；（缺口平移或切除冈崎片段5

44、引物）Klenow片段：53DNA聚合酶活性；35核酸外切酶活性；,pol 又称为DNA聚合酶全酶 真正的DNA复制酶。活性53DNA聚合酶活性35核酸外切酶活性pol 具有35核酸外切酶活性，所以在DNA修复中有作用。,原核DNA复制中的酶,拓扑异构酶,解链酶,5/3/,3/5/3/5/,DNA聚合酶,单链结合蛋白,DNA聚合酶,前导链 随后链,DNA连接酶,冈崎片段,引物酶,真核细胞中的DNA聚合酶,原核生物的DNA复制,起始复制原点引发体（起始复合物）形成：DnaA、DnaB、DnaC、组蛋白样蛋白（HU）、旋转酶、SSB。复制的延伸先导链的合成：35亲本链为模板；pol 全酶延伸。后滞

45、链的合成：随先导链的延伸置换出模板，其上RNA引物信号序列出现即合成RNA引物，pol 延伸冈崎片段，pol切除引物和填补空缺，DNA连接酶连接片段。,OriC in E.coli chromosomal DNA,大肠杆菌的DNA复制起点,四个9bp的重复序列 dnaA结合位点,三个13bp的重复序列,若干GATC位点,复制终止,由两个复制叉相遇而终止。终止序列：终止位点Ter，22bpDNA，结合特异的蛋白。专一性终止蛋白，Tus蛋白：结合到Ter位点，复制叉暂停。子代二价体的解套,子代二价体的解套,修复前进行，子代链上有缺口，由拓扑异构酶在亲本链上打开缺口，而解套；修复后进行，则由拓扑异构

46、酶在亲本链和子代链上打开缺口，而解套；,真核生物的DNA复制,多起点、双向复制复制单元较小 复制叉相遇而终止终止端粒的复制,SV40复制起始点4个5-GAGGC-3序列（大T抗原结合位点）；一个15bp的回文结构（复制时最早解链区域）；一个只有A-T组成的17bp区域（促进解链）；,原核生物和真核生物DNA合成的相同点,1.半保留复制2.半不连续性3.DNA 解链酶、SSB4.RNA 引物5.校正阅读（Proofreading）,原核生物和真核生物DNA合成的区别,原核生物和真核生物DNA合成的区别,复制起始的许可因子的控制（复制周期重叠与否）端粒和端粒酶真核中，同步合成组蛋白，形成核小体真核

47、中，全部染色体复制完成以前，各ori不能开始下一轮复制。,线粒体DNA复制过程,聚合酶负责mtDNA的复制。D环复制方式，又称置换式复制。H链为模板，从OH开始；新的L链取代原来的L链与H链互补结合；原来的L链呈D环；至1/3时暴露OL，起动以L链为模板的复制；复制完成，以环状双螺旋形式释放，形成两条环形DNA分子。,单链环状DNA的复制(x174 phage),第一阶段RF-DNA的形成“”链“/”链（RF-DNA）第二阶段滚环复制RF将作为复制的模板。（模式过程）“”链产生缺口RF；以“”链为模板，DNA聚合酶催化延伸反应；“”链被置换；gpA识别链复制原点，打开缺口，并结合于链5端；剪开

48、被完全置换的链，并促使其封闭成环；,线状 DNA复制5末端短缩的解决模式,从开始就采取环化的形式 噬菌体利用自身线性DNA末端的重复序列，通过末端互补形 成连环分子（二聚体）T7噬菌体采取连环分子的形式引入蛋白质直接从末端起始复制腺病毒末端发夹结构连接，复制完成后错切连接痘病病毒。端粒和端粒酶真核生物染色体DNA。,PCR反应的原理,高温变性：94左右，目的基因解链为单链，以作为扩增的模板；低温复性：5560，一对特异性引物分别与模板3端互补结合；适温延伸：72，延伸反应；每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后，理论上DNA分子可扩增为2n。,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应

49、结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物 primers,逆转录PCR（RT-PCR）,RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ngug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。该技术主要应用：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。,Taqman技术,利用Taq酶的53外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与DNA模板发生特异性杂交，探针的5端标以荧光发射基因，靠近3端标以荧光淬灭基团。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基

50、团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，可被荧光探测系统检测到。,Taqman技术（续）,复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针5端将探针切断，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。,基因突变,突变：DNA碱基序列发生的可遗传的永久性的改变。突变可发生在DNA的不同结构水平：染色体畸变基因突变突变原因不同：自发突变诱发突变；,突变的类型,碱基序列改变点突变：单点突变：只有一个碱基对