分子生物学技术和食源性致病菌的快速检测.ppt

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1、分子生物学技术和食源性致病菌的快速检测,与细菌有关的一些分子生物学和 细胞生物学技术;PCR技术;荧光PCR技术;相关的一些分子生物学技术在食源性致病菌 的快速检测技术中的应用;5.一实例分析个案,与细菌有关的一些分子生物学和细胞生物学技术,核酸的抽提与纯化(DNA,RNA,质粒DNA等)相关核酸的鉴定(PCR,限制性内切酶和酶切技术及 产物分析,重组技术,探针,Southern blotting,Northern blotting,芯片技术,序列分析等)蛋白质的提取与纯化相关蛋白质的鉴定(Western blotting,抗原抗体复合物,标记技术,芯片技术,序列分析等)培养细胞技术(用于细菌

2、毒素测定的MTT方法),核酸的抽提与纯化,DNA-微量法(平衡酚,氯仿,乙醇);大量法(碱列解);离心法RNA质粒DNA-碱变性法,Kit-Qiagen公司PCR产物-Kit细菌-直接裂解:释放出DNA,PCR-聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）,在体外通过酶促反应进行一段特定DNA或RNA片段扩增的技术为获取目的DNA片段的一项常规技术(诊断和检测)原理:,PCR一般过程：1.变性（denaturation）：加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单 链DNA。2.退火（annealling）：温度降低时使引物和其互补的模板在局部形成杂交链。3.

3、延伸（extension）：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸及Mg2存在的条件下，催化DNA链延伸反应。,模板DNA 或RNA 一对寡核苷酸引物 4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)热稳定的聚合酶(Taq)；Mg+缓冲液。,PCR-聚合酶链式反应体系,凝胶电泳：经溴化乙锭染色，在紫外照射下可见橙红色的特异DNA扩增带并可以在图象成像仪下成像。,PCR-聚合酶链式反应产物的检测,M 1 2 3 4 5 6 7 8 N P,PCR-聚合酶链式反应技术的发展,不对称PCR反向PCR多重PCR差别PCR荧光PCR锚式PCR重组PCRPCR固相分析免疫PCR反转录PCR(RT-PCR)原位PCR,荧光PC

4、R技术(Real Time PCR),荧光是响应于一个短波光的激发，一个长波长光被发射出来每个荧光分子都有一个最有效的激发波长-被激发的荧光分子越多，发射的荧光越强,荧光PCR技术(Real Time PCR),PCR+荧光标记+监测系统,Non-specific DNA binding dyesSYBR Green IEthidium Bromide Specific Hybridization ProbesTaqManTM molecular beaconsdual-oligo FRET pairs,荧光PCR技术(Real Time PCR),R,53,3,5,R,R,R,R,SYBR

5、Green I 是一种结合于小沟中的双链DNA染料,与双链DNA结合后,其荧光大大增强.,R,R,R,497nm,520nm,荧光PCR技术(Real Time PCR),TaqMan:杂交探针的互补区在引物间5端连有一个荧光reporter,通常是荧光素3端连有一个Quencher,通常是TAMRA荧光素被488 nm光激发，发射光为520 nm520 nm 光能激发TAMRA，发射光为570 nm,R,Q,53,3,5,R=ReporterQ=Quencher,probe,荧光PCR技术(Real Time PCR),分子 Beacons:探针有核心的杂交区探针有自互补末端在未杂交时探针呈

6、发夹状报道子,荧光素在探针的 5 端猝灭子在探针的3 端,FRET Probes,l,Detection,Extension Step,1.Strand DisplacementSystem Silent,2.PolymerizationCompleteSystem Silent,1-5 bases,荧光PCR技术(Real Time PCR),阈值线,CT值,阈值线:荧光阈值的缺省的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍.CT值:各反应管内的信号到达设定的阈值所经历的循环数.,荧光PCR技术(Real Time PCR),阈值线 CT值,多重荧光PCR技术,FAMVICHEXTETC

7、y3Texas RedROXCy5LC640Cy5.5LC705,490nm,660nm,R,限制性内切酶和酶切技术及重组,限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶.例如:EcoRI 可以识别5.G AATTC.33.CTTAA G.5 粘性末端T4连接酶:重组 酶切与多态性分析技术,GFP-MIP重组结构,MIP,mip基因是军团菌的巨嗜细胞感染增强子基因，具高度保守性和嗜肺军团菌种的特异性。表达的产物mip蛋白是迄今所公认的嗜肺军团菌毒力因子之一，是嗜肺军团菌所特有，因此用来鉴定军团菌具有很强的特异性。,GFP-MIP重组结构,Southern blotting

8、和Northern blotting技术,R6 GFP-ras,-Gp+Gp-Gp+Gp-Gp+Gp-Gp+Gp,4 10 4 10 days,raf(2.5 kb)Actin,28S18S,主要步骤:DNA(RNA)提取 和纯化;凝胶电泳;印迹转移;探针和杂交显色,芯片技术,主要步骤:芯片的制备DNA(RNA)提取 和纯化;探针的制备杂交显色结果判读,芯片技术,-Gp+Gp,芯片技术,T I II III IV C C,登革热病毒检测芯片:通用探针的设计,合成和筛选,修饰分型探针的设计,合成和筛选,修饰预试验,样品的处理;杂交及洗涤,条件优化等数据库的建立应用评价与多重PCR技术的比较,DN

9、A序列分析,双脱氧测序(Sanger法)化学测序(Maxam-Gilbert法)同位素标记测序市售商品或公司运作,DNA序列分析,Start-ATTAGACGTCCGA”T G CA ATTAGATTA ATTAGACGATTAGA ATTAGACGTCCG AT ATTAGAC ATT ATTAGACGTC ATTAGACGT ATTAGACGTCG A T G C-ATTAGACGTCCG-ATTAGACGTC-ATTAGACGT-ATTAGACG-ATTAGAC-ATTAGA-ATTAG-ATTA-ATT-AT-A,测序凝胶,DNA序列分析(I),DNA序列分析(II),DNA序列分析(

10、III),Western blotting技术,0 2 4 8 0 2 4 8 days,R6 GFP-ras,76 kD44 kD44 kD42 kD,Anti-Raf-1,Anti-Erk,Anti-p-Erk,Anti-Actin,Gp treatment,主要步骤:蛋白质的提取 和纯化;SDS-聚丙酰胺 凝胶电泳;印迹转移;抗体和杂交显色,胶体金检验法,氯化金在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶体溶液(胶体金).胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包埋过程.由于金具有高电子密度的特性,我们可以在显微镜下或是在有相应的配体处大量聚集时,肉眼可见紫色

11、的标记.,CT,CT,CT,CT,霍乱弧菌O1群(O139)快速检测卡:T-霍乱弧菌O1群(O139)单克隆抗体 C-羊抗鼠抗体,细胞培养技术,细胞培养的一般过程(细胞,培养基,实验室要求的条件等)细胞的复苏细胞的传代细胞的收获细胞的冻存细胞培养污染的防治培养细胞的观察等,MTT Assay,原理:黄色的Tetrazolium Salt(MTT)在活细胞线粒体SDH酶的作用下,生成蓝色产物.根据颜色的浓度来判定活细胞的数目,从而推断受试物的毒性大小.,MTT Assay,g,有关的一些分子生物学技术在食源性致病菌的快速检测技术中的应用,PCR技术;引物的设计(kit,文献,自行设计,原则,ge

12、ne bank);多重PCR;荧光PCR;分子分型及相关技术(结合细菌特征基因PCR和限制性片断长度多态性分析PCR-RFLP,核糖体基因分型Ribotyping,脉冲场电泳Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE),同源性分析,溯源和预警等,霍乱CtxA基因的PCR,霍乱CtxA基因的PCR,霍乱CtxA基因的PCR,1 gaattcccgg gttgtgggaa tgctccaaga tcatcgatga gtaatacttg cgatgaaaaa 61 acccaaagtc taggtgtaaa attccttgac gaataccaat ctaaagt

13、taa aagacaatat 121 ttttcaggct atcaatctga tattgataca cataatagaa ttaaggatga attatgatta 181 aattaaaatt tggtgttttt tttacagttt tactatcttc agcatatgca catggaacac 241 ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaacac acaaatatat acgctaaatg 301 ataagatatt ttcgtataca gaatctctag ctggaaaaag agagatggct atcattactt 361 t

14、taagaatgg tgcaattttt caagtagaag taccaggtag tcaacatata gattcacaaa 421 aaaaagcgat tgaaaggatg aaggataccc tgaggattgcatatcttact gaagctaaag 481 tcgaaaagtt atgtgtatgg aataataaaa cgcctcatgc gattgccgca attagtatgg 541 caaattaaga tataaaaaaa gcccacctca gtgggctttt ttgtggttcg atgatgagaa 601 gcaaccgttt tgcccaaaca

15、tgtattactg caagtatgat gtttttattc cacatcctta 661 gtgcgtatta tgtatgttat gttaaattaa ggcataaaaa gaggtcgcaa accccaatct 721 gctccctatt cttaatccag cattaaacat aactgtattt accataaaat acctaataat 781 catatttatc atttgacaat gttaagtatg attattatgg acattggcac tgtacttacg 841 tcaattgtgt gcaccaaagt g,霍乱CtxA基因,PCR扩增毒力基因

16、所用引物序列及扩增产物分子量,PCR扩增霍乱毒力基因及扩增产物分子量,M 1 2 3 4,ZotctxAtcpAace,多重PCR,最早用于缺少基因片断的检测;用于多基因的同时检测或进行细菌的属,种,型以及特异性基因段的同时检测;对猪链球菌2型:检索Genbank中猪链球菌的属、种及毒力基因的基因序列，利用Primer 5.0软件设计针对hemolysin gene（溶血素基因）、epf基因、NAD（P）H-dependent glutamate dehydrogenase gene（NAD（P）H依赖性谷氨酸盐脱氢酶基因）、rmlACBD基因进行引物设计,以后再按照国家CDC的有关指引补充了

17、针对猪链球菌种特异性16S rRNA片段和特异性荚膜多糖基因片段cps2J的特异引物.,多重PCR扩增霍乱毒力基因,M 1 2 3 4 5,ZotctxAtcpAace,1000200,M 1 2 3 4,多重荧光PCR技术及应用,FAMVICHEXTETCy3Texas RedROXCy5LC640Cy5.5LC705,490nm,660nm,R,R,Q,5,3,probe,R,Q,5,3,R,Q,5,3,R,Q,5,3,多重荧光PCR技术及应用,沙门氏,志贺氏;霍乱弧菌;副溶血性弧菌,病原性大肠埃希菌(出血性大肠杆菌O157：H7，致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌)，变形杆菌

18、、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌;空肠弯曲菌;厌氧菌(空弯,产气荚膜梭菌,肉毒梭菌);,分子分型及相关技术,意义:1.欧洲和美国 等已成立了细菌分子分型国家电子网络（PulseNet),包括沙门菌、志贺菌、弯曲菌、出血性大 肠杆菌O157：H7、李斯特菌、耶尔森菌和弧菌）;2.国内尚无细菌分子分型的数据库和网络运作系统;3.没有在溯源、食源性疾病(食物中毒)疫情判断和确认 及预警的实际工作中应用,分子分型及相关技术,近十年来发展并应用了多种以直接分析基因多态性为依据的高分辨率的分子分型系统，包括：用低频率（30%）的内切酶裂解DNA，通过脉冲

19、场凝胶电泳（PFGE）将切成的大片段分开，根据条带的大小及数量差异来分型的PFGE；限制性酶切与Southern印迹杂交技术结合，采用rRNA或rDNA序列探针的核糖体基因分型（Ribotyping）；以PCR为基础的的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP），扩增片段长度多态性分析（AFLP）、随机扩增多态性DNA分析（RAPD）以及多位点序列分型（MLST）DNA测序。,常用基因分型方法的特点,RAPD分析霍乱弧菌的同源性,M 1 2 3 4 5 6 7,利用单一的任意序列的引物，随机地扩增与靶序列完全或部分配对，以扩增出特异的DNA产物，然后进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据电

20、泳条带的不同，即所谓的多态性就可进行基因定位、连锁图建立、品系(种)鉴别等方面。由于该技术具有快速灵敏，程序简便等优点,因此在短时间内，已广泛应用于生物学研究领域.,聚类分析,凝胶成像系统得到RAPD图像后，直接在其软件中根据Marker及随机扩增片段在凝胶中的位置计算不同扩增片段的分子量大小，然后采用SPSS统计软件或其它聚类分析软件，根据片段的分子量数据进行聚类分析。,同源性分析,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18,M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34,250020001

21、00075050020001000750500,例一,例二,利用SPSS软件对前2图进行聚类分析，根据遗传距离的差异，将34株霍乱弧菌分成了2个聚类群，每个聚类群内部菌株的遗传距离基本相同，反映了这2组菌株的亲缘关系较近。,同源性分析,肠杆菌科细菌rRNA 基因的系统发育树,16S,23S,核糖体基因分型Ribotyping,核糖体基因分型,伤寒沙门菌16S rRNA 基因扩增片段的酶切鉴定:Bca I 酶切,脉冲场电泳及相关技术,脉冲场电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)通过交替改变的电场方向,使数百万碱基大小的DNA分子变向,并已不同的迁移速度

22、通过凝胶胶孔,从而分离DNA分为三个主要步骤：分离完整的DNA；限制性酶切；电泳；PFGE所采用的内切酶为寡切点酶，酶的选择对流行病学分析至关重要，在食源性疾病暴发调查和预警中，根据所研究菌种和所要达到的分辨率的不同应选择不同的酶。遗传学相关度越高的菌株，其限制性片段的数量和大小越接近。因此，根据凝胶条带型的异同，结合流行病学相关资料就可以判断菌株间的流行病学相关性。,与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，它采用变焦电源，交替改变电场方向，使大片段DNA在凝胶中不断重新定向，DNA分子(100bp-10Mb)越大，这种重排所需要的时间越长，若DNA分子变换方向的时间小于电泳周期时，DNA分子就可以按其大小分开；,脉冲场电泳及相关技术,脉冲场电泳及相关技术,一实例分析个案,一起由副溶血弧菌引起的食物中毒的 实验室检测生化鉴定 对氧化酶阳性，葡萄糖氧化发酵有动力的菌株进行生化鉴定及血清学分型;显微镜检查:溶血试验:毒力试验:动物试验,MTT试验;药敏试验:毒力基因检测:副溶血弧菌toxR tlh,tdh(Tdh-related hemolysin)和trh(thermostable direct hemolysin）同源性分析:,Trhtdh,副溶血弧菌毒力基因检测,同源性分析,Thank you!,