分子生物学基础PPT第五章.ppt

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1、分子生物学基础,第五章遗传信息的翻译从mRNA到蛋白质,第一节参与蛋白质生物合成的物质,一、mRNA和遗传密码 1遗传密码及其破译 2遗传密码的性质（1）遗传密码的连续性（2）遗传密码的简并性（3）遗传密码的摆动性（4）遗传密码的普遍性和特殊性（5）遗传密码的防错功能,第一节参与蛋白质生物合成的物质,第一节参与蛋白质生物合成的物质,图5-1除Arg以外，编码某一特定氨基酸的密码 子个数与该氨基酸在蛋白质中的出现频率吻合,第一节参与蛋白质生物合成的物质,图5-2mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子配对示意图,第一节参与蛋白质生物合成的物质,第一节参与蛋白质生物合成的物质,第一节参与蛋白质生物

2、合成的物质,第一节参与蛋白质生物合成的物质,二、tRNA与氨基酸的转运 1tRNA的结构（1）tRNA的二级结构tRNA的三叶草形二级结构如图5-3所示。,图5-3tRNA的三叶草二级结构,第一节参与蛋白质生物合成的物质,tRNA的稀有碱基含量约有70余种。每个tRNA分子至少含有2个稀有碱基，最多有19个稀有碱基，多数分布在非配对区，特别是在反密码子3 端邻近部位出现的频率最高，且多为嘌呤核苷酸。这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对很重要。基因组研究表明，原核生物与真核生物细胞中所拥有的各种tRNA基因总数有很大不同，见表5-6。,第一节参与蛋白质生物合成的物质,（2）t

3、RNA的三级结构 酵母和大肠杆菌tRNA的三级结构都呈倒L形折叠式，这种结构是靠氢键来维持的，共有9个氢键帮助形成tRNA 分子的三级结构。tRNA的三级结构与氨酰-tRNA合成酶的识别有关。受体臂和TC臂的杆状区域构成了第一个双螺旋，D臂和反密码子臂的杆状区域形成了第二个双螺旋，两个双螺旋上各有一个缺口。TC臂和D臂的套索状结构位于倒 L的转折点。氨基酸受体臂在L形的一端，反密码子臂则在另一端。tRNA的倒L形结构如图5-4所示。,第一节参与蛋白质生物合成的物质,图5-4tRNA的倒L形三级结构,第一节参与蛋白质生物合成的物质,2tRNA的功能 转录是遗传信息从一种核酸分子（DNA）转移到另

4、一种结构上极为相似的核酸分子（RNA）的过程，信息转移依靠碱基配对。翻译则是遗传信息从mRNA分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联密码子形式存在的，在此起作用的是tRNA的解码机制。根据Crick的接合体假说，氨基酸必须与一种接合体接合，才能被带到RNA模板的恰当位置上正确合成蛋白质。因此，氨基酸在合成蛋白质之前必须通过AA-tRNA合成酶活化，在消耗ATP的情况下结合到tRNA上，生成有蛋白质合成活性的AAtRNA。同时，AAtRNA的生成还涉及信息传递的问题，因为只有tRNA上的反密码子能与mRNA上的密码子相互识别并配对，而氨基酸本身不能识别密码子，只有

5、结合到tRNA上生成AAtRNA，才能被带到mRNA核糖体复合体上，插入到正在合成的多肽链的适当位置上。,第一节参与蛋白质生物合成的物质,3tRNA的种类（1）起始tRNA和延伸tRNA起始tRNA是指能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA，其他的tRNA统称为延伸tRNA。（2）同工tRNA由于一种氨基酸可能有多个密码子，为了识别该氨基酸就有多个tRNA，即多个tRNA代表一种氨基酸。为此将几个代表相同氨基酸的tRNA称为同工tRNA。在一个同工tRNA组内，所有tRNA均专一于相同的氨酰-tRNA合成酶。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸各种同义密码子，又要有某种结构上

6、的共同性，能被AA-tRNA合成酶识别。所以同工tRNA组内肯定具备了足以区分其他tRNA组的特异构造，保证合成酶能准确无误地加以选择。（3）校正tRNA在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质的合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变称为无义突变。无义突变的校正tRNA可通过改变反密码子区校正无义突变。大肠杆菌无义突变的校正tRNA见表5-7。,第一节参与蛋白质生物合成的物质,第一节参与蛋白质生物合成的物质,三、核糖体与肽链装配 1核糖体的结构 原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物

7、核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为大、小两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。这些大分子rRNA能在特定位点与蛋白质结合，从而完成核糖体不同亚基的组装。在大肠杆菌内，RNA和蛋白质的比例约为21，在其它许多生物体中则为11。大小亚基均含有许多不同的蛋白质。小亚基（30S）由1种RNA（16S，1542个核苷酸）和21种蛋白质组成，大亚基（50S）由2种RNA（23S，2904个核苷酸和5S，120个核苷酸）和34种蛋白质组成。,第一节参与蛋白质生物合成的物质,第一节参与蛋白质生物合成的物质,原核生物和真核

8、生物核糖体中的蛋白质种类和RNA组成见表5-9。,第一节参与蛋白质生物合成的物质,核糖体结构模型及原核与真核细胞核糖体大小亚基比较如图5-5所示。核糖体分子可容纳两个tRNA和约40bp长的mRNA。,图5-5核糖体结构模型及原核与真核细胞核糖体大小亚基比较(a)电子显微镜模式图。大亚基位于整个分子的左侧，细绳代表mRNA位于两个（b）原核生物70S和真核生物80S核糖体,第一节参与蛋白质生物合成的物质,2rRNA 核糖体内的所有rRNA在形成核糖体的结构和功能时都起着重要作用。3核糖体的功能 核糖体存在于每个进行蛋白质合成的细胞中。虽然在不同生物体内其大小有别，但组织结构基本相同，而且所执行

9、的功能也完全相同。在多肽合成过程中，不同的tRNA将相应的氨基酸带到蛋白质合成部位，并与mRNA进行专一性的相互作用，以选择对信息专一的AA-tRNA。核糖体还必须能同时容纳另一种携带肽链的tRNA，即肽基-tRNA，并使之处于肽键易于生成的位置上。,第二节蛋白质生物合成的过程,蛋白质生物合成亦称为翻译，即把mRNA分子中碱基排列顺序转变为蛋白质或多肽链中的氨基酸排列顺序的过程。蛋白质生物合成主要包括下列步骤：翻译的起始核糖体与mRNA结合并与氨酰-tRNA生成起始复合体；肽链的延伸核糖体沿mRNA5端向3端移动，使多肽链的合成从N端向C端的方向进行；肽链的终止以及新合成多肽链的折叠和加工核糖

10、体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应。各阶段必须的成分见表5-10。,第二节蛋白质生物合成的过程,第二节蛋白质生物合成的过程,一、氨基酸的活化 原核生物的起始tRNA是fMet-tRNAfMet，真核生物的起始tRNA是Met-tRNAMet。原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合体。起始复合体的生成除了需要GTP提供能量外，还需要Mg2+、NH4+及3个起始因子（IF-

11、1、IF-2和IF-3）。起始因子与30S小亚基的结合较为松散，用1mol/L NH4Cl处理即可使之游离。,第二节蛋白质生物合成的过程,二、翻译的起始 1原核生物蛋白质合成的起始 起始阶段的主要任务是在mRNA 分子的正确起始点即起始密码子处完成完整核糖体的组装。蛋白质翻译的起始复合体包括：30S 核糖体小亚基、mRNA、fMet-tRNAfMet、三个起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）、GTP、50S 核糖体大亚基、Mg2+。翻译的起始又可被分成三步，如图5-7所示。,第二节蛋白质生物合成的过程,图5-7蛋白质翻译起始过程,第二节蛋白质生物合成的过程,IF-1和IF-3与游离的30S

12、核糖体小亚基相结合，以阻止在与mRNA结合前30S亚基与大亚基的结合，从而防止无活性核糖体的形成。由30S小亚基、起始因子IF-1和IF-3及mRNA所组成的复合体立即与GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相结合。起始tRNA通过其反密码子与mRNA分子上AUG密码子配对，与上述复合体结合，同时释放IF-3。IF-3的作用在于保持大小亚基彼此分离状态，以及有助于mRNA结合。此时的复合体称为30S起始复合体。30S起始复合体再与50S大亚基结合，替换出IF-1和IF-2，而GTP在此耗能过程中被水解。起始后期形成的该复合体被称为70S起始复合体。,第二节蛋白质生物合成的过程,如图5-8

13、所示。其中IF-3的功能是使核糖体的30S和50S亚基保持分开，其它两个起始因子IF-1及IF-2的功能则是促进fMet-tRNAifMet及mRNA与30S小亚基的结合。如前所述，mRNA的SD序列可与小亚基上16S rRNA的3进行碱基配对，起始密码子AUG可与起始tRNA上的反密码子进行配对。当30S小亚基结合上fMet-tRNAifMet以及与mRNA形成复合体后，IF-3就解离下来，以便50S大亚基与复合体的结合，后一结合使IF-2离开核糖体，同时使结合在IF-2上的GTP水解，原核生物的起始过程需要1分子GTP水解成GDP及磷酸提供能量。,第二节蛋白质生物合成的过程,图5-8原核生

14、物蛋白质合成起始复合体的形成,第二节蛋白质生物合成的过程,2真核生物蛋白质合成的起始 真核生物蛋白质合成的起始需要更多的蛋白质因子eIF参与，目前至少发现有9种，其中有些因子含有多达11种不同的亚基。但对它们的功能了解甚少，主要过程如图5-9所示。与原核系统类似，eIF-3使40S的小亚基与大亚基分开，但其间的反应不同。Met-tRNAiMet首先与小亚基结合，同时与eIF-2及GTP形成起始四元复合体，该复合体再在多个因子的帮助下开始与mRNA的5端结合。其中eIF-4因子含有1个特殊的亚基，能特异性地结合在mRNA的5端帽子结构上。结合在mRNA上后，核糖体小亚基就开始向3端移动至第一个A

15、UG，这种移动由ATP水解为ADP及磷酸来提供能量。,第二节蛋白质生物合成的过程,图5-9真核生物蛋白质合成起始复合体的形成,第二节蛋白质生物合成的过程,三、肽链的延伸 肽链延伸也可被分为三步：1第一步，进位 氨酰-tRNA首先必须与GTP-EF-Tu复合体相结合，形成氨酰-tRNA-GTP-EF-Tu复合体并与70S中的A位点相结合。此时，GTP水解并释放GDP-EF-Tu复合体。如图5-11所示。2第二步，转肽 转肽是形成肽键的反应，转肽如图5-12所示。该过程是在延伸因子从核糖体上解离下来的同时进行的。催化这一过程的酶是存在于核糖体大亚基上的23S tRNA与酶蛋白称为肽酰转移酶，催化的

16、本质是使一个酯键转变成一个肽键，由新加入的氨酰-tRNA上氨基酸的氨基对肽酰-tRNA上酯键的羰基进行亲核反应而成。,第二节蛋白质生物合成的过程,3第三步，移位 移位是延伸过程的最后一步，如图5-13所示。该过程由移位因子EF-2催化（原核中为EF-G，真核中为EF-2）。核糖体的移位需要EF-G和另一分子GTP水解提供能量。移位的目的是使核糖体沿mRNA向下游移动，使下一个密码子暴露于核糖体的合适位点以供继续翻译。此过程除需EF-2外，还需GTP、Mg2+。按进位转肽移位，每进行一次核糖体循环，就在肽链上增加1个氨基酸残基。以嘌呤霉素作为抑制剂通过实验表明，核糖体端mRNA移动与肽基-tRN

17、A的移位这两个过程是偶联的。肽链延伸是由许多这样的反应组成的，原核生物中每次反应共需3个延伸因子，EF-Tu、EF-Ts、EF-G，真核生物细胞需EF-1、及EF-2，消耗2个GTP，向生长中的肽链加上一个氨基酸。,第二节蛋白质生物合成的过程,图5-11细菌中肽链延伸的第一步反应：进位,第二节蛋白质生物合成的过程,图5-12转肽,第二节蛋白质生物合成的过程,图5-13细菌中肽链延伸的第三步反应：移位,第二节蛋白质生物合成的过程,四、翻译的终止 翻译的最后一步涉及到肽酰-tRNA中连接tRNA和C端氨基酸酯键的切断，这一过程需要终止和释放因子（RFs）。核糖体与mRNA的解离还需要核糖体释放因子

18、（RRF）的参与。细胞中通常不含能识别3个终止密码子的tRNA。在大肠杆菌中，当终止密码子进入核糖体上的A位点后，即被释放因子识别。RF-1可识别UAA和UAG，RF-2识别UAA和UGA，RF-3有助于RF-1和RF-2的活性。释放因子使肽酰转移酶将多肽链转至H2O分子而不是通常的氨酰-tRNA，释放出mRNA并与核糖体亚基完全解离。当释放因子识别在A位点上的终止密码子后，存在于大亚基上的肽酰转移酶专一活性转变成了酯酶活性，以水解新生合成的肽链。原核生物蛋白质合成中新生肽链的释放如图5-14所示。,第二节蛋白质生物合成的过程,图5-14原核生物蛋白质合成中新生肽链的释放,第二节蛋白质生物合成

19、的过程,体外实验中，当大肠杆菌的核糖体与fMet-tRNAiMet、RF-1两个三聚核苷酸AUG和UAA混合后，通过水解生成甲酰蛋氨酸，如图5-15所示。蛋白质生物合成的全部过程如图5-16所示。,图5-15体外释放因子活性实验,第二节蛋白质生物合成的过程,图5-16蛋白质生物合成过程总过程,第三节翻译后的加工,一、N-端f-Met或Met的切除 原核生物的肽链，其N-端不保留fMet，大约半数蛋白由脱甲酰酶除去甲酰基，留下Met作为第一个氨基酸；在原核及真核细胞中fMet或者Met一般都要被除去，此过程是由氨肽酶水解来完成的。水解的过程有时发生肽链合成的过程中，有时在肽链从核糖体上释放以后。

20、至于脱甲酰还是除去fMet常与邻接的氨基酸有关。如邻接的氨基酸是Arg，Asn，Asp，Glu，Ily或Lys以脱甲酰基为主，如邻接的氨基酸是Aly，Gly，Pro，Thr或Val则常除去fMet。,第三节翻译后的加工,二、二硫键的形成和羟化作用 1二硫键的形成 mRNA中没有胱胺酸的密码子，胱氨酸中的二硫键是通过2个半胱氨酸的-SH基氧化形成的，肽链内或肽链间都可形成二硫键，二硫键在维持蛋白质的空间构象中起了很重要的作用。2羟化作用 有些氨基酸如羟脯氨酸、羟赖氨酸没有对应的密码子，这些氨基酸是在肽链合成后由羟化酶催化氨基酸残基发生羟化而成，如胶原蛋白中的羟脯赖氨酸就是以这种方式形成的。,第三

21、节翻译后的加工,三、化学修饰 1折叠 在ER腔中折叠和修饰是有关的，糖的连接对于正确的折叠十分必要。蛋白二硫异构酶（PDI）可以改变二硫键，影响到折叠，它必须和特殊的ER蛋白相结合，此酶的某些活性或全部活性可能是酶作为ER中的一种复合体的形式来实现的。即在越膜位点和蛋白结合才能发挥它的功能。通过对折叠和寡聚物产物的计算表明折叠需要一种酶来催化，使其在细胞中迅速发生。一个与折叠功能有关的蛋白是BiP，它是分子伴侣Hsp70家族的一个成员。BiP促使寡聚物的形成ER腔中蛋白的折叠。ER可能含有各种辅助蛋白，它们的功能是识别蛋白折叠的形态，以帮助这些蛋白产生一种构象，使其可迅速地转运到下一个目标。大

22、部分膜上的糖蛋白，都是寡聚物，一般在ER中寡聚，然后迅速地从ER转到高尔基体，但不装配亚基或者防止蛋白酶装配。错折叠的蛋白常和BiP相联，在这种情况下他们会被降解掉，若折叠正确，那么就可以转运到高尔基体或继续转运。BiP有两个功能：帮助转运蛋白折叠；切除错折叠蛋白。,第三节翻译后的加工,2在ER中的糖基化及修整 实际上所有的分泌蛋白和膜蛋白几乎都是被糖基化的蛋白。糖基化有两种类型：糖蛋白是由寡糖连接在Asp的氨基所形成的，连接的链称为N-糖苷键。寡糖连接在Ser、Thr或羟基-lys的羟基上（O-糖苷键）。N-糖苷键是在ER开始，而在高尔基体中进一步完成；O-糖苷键的形成仅发生在高尔基体中。3

23、在高尔基体表面的进一步加工 复合寡聚糖是在高尔基体中进一步修整和加上糖的残基。第一步是通过高尔基体的甘露糖苷酶修整甘露糖残基。然后单个的糖基由N-乙酰-葡萄糖胺转移加上，按着由高尔基体苷露糖苷酶继续切除苷露糖残基。在这一位置上寡糖通过内-糖苷酶H使寡变成对降解产生抗生。对Endo H的易感性被用来作为一种测验，从而测定一个糖蛋白是处于什么阶段。,第三节翻译后的加工,四、剪切 蛋白内含子又称为内蛋白子，是近年发现的一种新的翻译后加工的产物。它是1994年由Perler等首先提出的。蛋白外显子又称为外蛋白子。内蛋白子的基因不是单独的开放阅读框（ORF）它是插入在外蛋白子的基因中和内含子的区别在于它可以和外蛋白子的基因一道表达，而不是其mRNA被切除，产生前体蛋白以后再从前体中被切除掉，余下的外蛋白连接在一起成为成熟的蛋白，这也不同于胰岛素，胰岛素的A键和B键本身是不相连接的，仅仅通过二硫键将两个片段连在一起。,