分子生物学在兽医中的应用.ppt

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1、分子生物学在兽医中的应用,目录,一：分子生物学技术在中兽医药学中的应用进展,中兽医学起源于中国古代，经过数千年的发展而形成了独特的理论体系和丰富的诊疗手段，是中国历代劳动人民同疾病进行斗争的经验总结，其主要内容包括基础理论、诊法、中药、方剂、针灸和病证防治等部分。然而，要使中兽医学走向世界，仅凭传统中兽医理论是不够的，必须使之与现代医学结合，从现代医学的角度阐明中兽医辨证原理及中兽药的作用机理，实现传统中兽医药学现代化。而分子生物学使人类对生命现象、生物结构和功能的认识已产生了一系列的突破，中兽医药理论与分子生物学虽然属于两种不同的体系，但两种科学研究生命活动的物质基础是一致的，因此，从分子水

2、平研究中兽医药，对推动中西兽医结合、促进中兽医药学的发展和防病治病很有意义。,1分子生物学技术在中兽医基础理论中的应用,11 阴阳学说与分子生物学技术 阴阳学说贯穿于中兽医学理论体系的各个方面，用以说明动物体的组织结构、生理功能和病理变化，并指导临床诊断和治疗，是中兽医理论的高度概括。近几年来，我国对cAMP、cGMP与中兽医阴阳学说进行了研究。李芳生报道，阳虚者cAMP水平升高，cAMPcGMP比值下降；阴虚者cGMP水平升高，cAMPcGMP比值升高。进一步分析cAMP、cGMP与阴虚和阳虚的关系可知，阳虚者表现副交感神经系统活动加强；阴虚者主要表现交感神经系统活动加强。这些研究都为推动中

3、医理论向现代化迈进有重要意义。素问至真要大论中说“谨察阴阳所在而调之，以平为期”，是中医临床诊断和治疗的基本原则。与此理论相一致，分子生物学技术研究发现，正常细胞染色体上存在非活化状态的原癌基因，同时还存在抑癌基因。如前者激活，基因异常表达；或后者缺失而不能发挥正常细胞生长调节和终止分化作用，就可导致肿瘤发生，这说明原癌基因与抑癌基因两者平衡失调对肿瘤发生起着重要作用。,12脏腑学说与分子生物学技术,脏腑学说是研究动物机体各脏腑器官的生理活动、病理变化及其相互关系的学说。肾藏精，主命门之火，是机体的先天之本，对机体的生长、发育、生殖有重要影响。杨金蓉运用“恐伤肾”原理恐吓母鼠，造成子鼠先天肾气

4、亏虚的动物模型，然后检验子鼠胸腺核酸含量，发现恐吓各组DNA、RNA含量及RNADNA值均有所降低，且恐吓程度越重，降低越明显。王米渠报道受惊吓母鼠所产子鼠大脑皮层厚度变薄，尤以分子层明显变薄，说明围产期紧张情绪直接影响到下一代子鼠的生长发育。用RTPCR技术发现肾阳虚证和下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素的mRNA表达受抑，将肾阳虚证定位在下丘脑。脾统血，主运化，是机体的后天之本。王晓明等通过脾气虚证大白鼠模型LPO及其相关抗氧化酶变化研究，提示中医认为“脾为后天之本”在生理上同分子生物学水平的抗氧化酶活性和(含量)的正常，从而维持了生物膜的正常功能的认识相类似，对中医“脾”的本质的现代化科学解释

5、有一定的学术意义。这一切都说明中医脏象学说是有分子生物学基础的。,13 中兽医证的研究与分子生物学技术,证，即证候，是对疾病发展过程中某一阶段病因、病机、病性、邪正双方力量对比等方面情况的概括，是中医的核心问题。而辨证施治就是针对证的差异，以四诊为依据，认识疾病、诊断疾病的过程。故中医有“有诸于内必行诸于外”的说法。中兽医中的同病异治、异病同治在分子生物学上的体现就是将同一疾病不同证候和同一证候不同疾病的动物进行基因图谱表达，观察分析其基因突变、异常表达同疾病的关系。从中西医结合的角度，中医证本质的含义是指引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的动态变化过程。证研究的突破，对于解释中兽医的

6、科学内涵，推动中医各学科的发展具有十分重要的意义。分子生物学对于蛋白质研究的突破将为证候与蛋白质的结合研究奠定基础，在这一方面，有关蛋白质芯片的深入研究和纳米技术的使用将为蛋白质的研究与中医证候的研究提供发展的契机。而证候一基因组学也是中医现阶段研究的一个重要课题，将宏观的中医证候与微观的基因功能相联系。为中医证候的现代化研究提供了新的探索路径。目前运用分子生物学技术对于脏腑辨证的研究比较多，在一定程度上揭示了这些理论的分子生物学基础。如钟历勇等观察补肾、健脾、活血三类复方对下丘脑一垂体一肾上腺一胸腺轴(HPAT)受抑模型的下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)基因表达的影响，从分子水平阐明

7、药物对阳虚证的主要调节点。结果表明惟有补肾药可通过提高下丘脑CRF mRNA表达来保护HPAT轴免受外源性皮质酮的抑制。,健脾药对免疫系统有直接的促进作用，而活血药对HPAT轴无任何影响，其结论是药物对肾阳虚证的主要调节位点在下丘脑。刘福春等通过H2一TdR掺入细胞核DNA的方法。发现“阳虚”动物骨髓细胞DNA合成率下降，认为中医肾主骨生髓藏精理论与促进核酸蛋白质代谢有关。通过对中药抗衰老作用机制的研究发现端粒长度缩短与衰老有关。端粒是线形染色体末端的特殊结构，含有DNA高度重复序列，随着细胞的衰老，血液及结肠黏膜细胞中端粒的平均长度在不断减少，抗衰老中药的作用可能表现在对端粒DNA重复序列有

8、保护作用。而中药通过提高DNA的修复能力、清除自由基、增强神经生长因子(NCF)受体等作用来达到抗衰老之目的。标准化、规范化是涉及中医药科研各个领域亟待解决的难题，也是中医药现代化、国际化的基础。要实现这一目标，引入被医学界公认为对指导临床实践、制定计划、解释结果和临床决策具有重要价值的方法学是完全有必要的。目前对于证的研究只是从某一角度进行了分子生物学微观阐述，但却为辨证施治提供了一条新的思路,分子生物学技术在中医临床中的应用,在中兽医辨证施治的原则下，从分子水平寻求中药制剂疗效确切的客观依据，不仅证实了中药的有效性，而且展现了中医药防治疾病的广阔前景。如马增春等用蛋白质组技术考察四物汤对血

9、虚证小鼠血清蛋白的影响，在分子水平上探讨四物汤补血的作用机制。成玉斌等探讨了肾虚型糖尿病肾病(DN)与肾素血管紧张素转移酶(ACE)基因多态性的相关性。虚证的主要病因之一可能是由于某些机体功能受到抑制等原因导致基因功能普遍下降。所以在基因芯片技术中可见大规模基因下调。例如NM一002462人类黏液病毒(流感病毒)抵抗子l一干扰素类蛋白p78(小鼠)mRNA，该基因不但与RNA聚合酶亚单元PB2作用，并且与流感NP作用而抑制流感病毒的转录，是嗜中性粒细胞独立的旁分泌因子抗病毒基因。该基因表达下调：与中医理论“正气存内，邪不可干”有关，正常机体的防御卫外功能下降正是虚证的病机病理之一。另外虚证会导

10、致某些机体功能的虚性亢奋。与部分上调基因可能有关，如NM一005896IDH，它的活性与脂肪的生物合成相关。吴志奎等根据中医理论，采用补肾生血对B一地中海贫血进行治疗，能明显提高地中海贫血患者血红蛋白和抗碱血红蛋白，提高血红蛋白链比，通过BTPCR检测，该药物能促进珠蛋白的mRNA基因转录和表达，诱导HbF合成，从而代偿了-珠蛋白基因缺陷。王振义从分子生物学水平研究早幼粒细胞白血病的发病机理，运用砒霜治疗白血病，印证了中医“以毒攻毒”的治疗方法，疗效十分理想。最近报道，半胱氨酸酶的激活可能是砒霜诱导NamMwa细胞凋亡的机制之一。,分子生物学技术在中药研究中的应用,31 分子生物学技术与中药作

11、用机理的研究我国的中药资源丰富，具有完整的理论体系应用法则，中药中的有效成分通过多途径、多环节、多靶点调节机体内部的动态平衡。中药多采用复方，讲究君、臣、佐、使。以求各味药之间能协同作用。由于成分复杂，研究起来比较困难，这就要求采用分子生物学技术分离中药有效成分进行中药现代化的研究。1994年，Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组。化学蛋白质组学是利用化学小分子直接从功能角度切入蛋白质组的研究，通过化学小分子处理前后的差异蛋白质组展示，研究蛋白质的翻译后修饰过程。这种研究模式为中药对机体的作用机制提供了研究平台。分子生物学技术应用于中药药理的研究开始于中药单体的研究，集中于人参三

12、醇皂苷、云芝多糖等中药单体对细胞内相关因子及受体mRNA转录、基因表达上有调控作用。对于中药复方的研究尚处于起步阶段。我国学者曾对人参、黄芪、青蒿、淫羊藿、银耳、灵芝等药物对体内重要的细胞因子(ILl、IL一2、IL一3、IL一6、TNF等)的基因表达调控机体的免疫反应做了探讨。曹颖英等26 J应用斑点杂交法研究表明，淫羊藿苷(ICA)可促进刀豆蛋白(ConA)诱导的淋巴细胞IL一3 mRNA、IL一6 mRNA的表达，其促进作用具有一定的剂量依赖性，且它对IL一6 mRNA表达的促进作用优于IL一3 mRNA，初步阐明了ICA促进某些细胞因子产生的分子机制。王平等研究了加味温胆汤对日本快速老

13、化模型鼠肝细胞核活性基因的影响，结果表明，加味温胆汤具有提高SAMP10鼠肝细胞核活性基因水平、增强其转录活性的作用。,用细胞培养的方法研究发现，复方补益剂(四君子汤、四物汤、八珍汤、十全大补汤)对细胞生长均有显著促进作用，而且不同补益剂对同种细胞的促生长作用明显不同，同种补益剂对不同细胞或同种细胞的不同生长时期作用也不完全相同。贺双腾等运用Nohem杂交检测到，加入补肾醒脑解毒复方中药煎液后，感染神经元NGF和BDNF表达较正常海马神经元明显提高并且能持续增加，维持潜伏感染神经元存活达lO周以上。凌云彪等30 J利用核素掺人试验、流式细胞术观察到，通过两种不同途径制备的中药复方“肝纤方”可以

14、抑制大鼠肝星状细胞(HSC)的增殖及其胶原合成。随着中医药防治肿瘤研究的广泛与深入，疗效高、副作用小、多靶位、多环节抗肿瘤中药的研制，将是未来肿瘤防治的希望。日本学者对小柴胡汤的研究发现，柴胡汤水溶液能诱导肝癌细胞KIM一1和胆管细胞KMCl凋亡。而不影响正常细胞。另有日本学者报道，黄芪苷元能有效抑制扑拓异构酶一2的活性和3种肝癌细胞系的增殖，并能诱导KIM一1细胞发生凋亡，诱导HuH一7、HLF细胞坏死。孙饶鸿等采用流式细胞技术发现消瘤饮(根据益气解毒抗癌的原则组成的治疗肿瘤中药方剂)具有明显的抑瘤作用，可促使b娃基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡。,分子生物学技术与中药鏊定,我国中药材资源丰富，种

15、类繁多，过去一直采用形态学分类法来鉴定中药材。这种建立在宏观监测水平上的方法往往不完善，尤其是动物药及破碎中药的鉴定，这也是中药质控的难点，而蛋白质电泳法和核酸分析法作为新的分子生物学技术正在中药鉴定中广泛应用。任冰如等用RAPD技术(随机扩增多态性DNA)对南、北苍术不同居群间的亲缘关系做了鉴定，从DNA水平上证实了南、北苍术亲缘关系很近，差异很小，从而证实了北苍术是南苍术的变种，而非不同种。罗志勇等m运用AFLP技术(扩增片断长度多态性法)成功构建出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参指纹图谱，并运用计算机软件对结果进行二维图象处理，计算出不同样品间相似度指数，并从相似度指数发现西洋参与引种

16、到我国吉林的西洋参的DNA发生一定的变异，但变异程度小于人参与西洋参间的差异。国外学者运用各种分子标记法对淫羊藿属、黄芪属、贝母属、栝楼属、苍术属、沙参属、紫苏属、天南星属等药用植物进行了较为系统的研究。此外，DNA分子标记方法还可用于中成药质量分析，如台北医学院利用RAPD标记技术成功检出玉屏风散中的白术、黄芪和防风3味药材，台湾药物食品检测局利用PCR技术成功鉴别出四物汤中当归和中降汤中大和当归成分。,分子生物学技术与中药品质改良,由于野生药材资源日益减少，栽培品种品质退化，有效成分含量不足以及农药残留量超标等一系列问题，给中药材质量控制和临床应用带来了一定困扰。胡之璧引用植物细胞培养技术

17、进行洋地黄培养细胞的生物转化研究，筛选出高产细胞并获得了遗传稳定性。另外，还可以应用转基因技术开发新药。如国外报道可从转基因绵羊羊奶50蛋白质中提取出抗胰蛋白酶用于临床疾病的治疗。,二：分子生物学软件在动物医学研究中的应用,分子生物学作为基础学科，在动物医学研究领域（动物疾病发生机理、诊断与预防）中的应用不断拓展，其相关应用软件已成为广大研究人员必不可少的辅助工具，熟练掌握一套相关生物学软件的使用，可以为科研工作者节省大量宝贵的时间，并起到事半功倍的效果。但是其应用软件的种类和数目层出不穷，即使某些功能的相似的软件，其开发环境、运行平台和操作方法都各不相同，有些软件还涉及的一些计算机语言的使用

18、，而我国大多数动物医学研究人员使用的是Windows操作系统作为工作平台，而且对相关计算机语言了解不多，这就给使用者造成了许多的不便。因而很有必要推荐一些较为实用软件给从事动物医学研究的科研工作者 结合从事相关研究和自己的实践经验，就动物医学中涉及到的软件，按照一定的顺序介绍如下。,1 参考文献收集整理,作为相关专业的科研工作者，首先要对自己的研究内容和国内外研究现状有所了解，这就需要参阅大量的文献资料，在这里向大家推荐书目资料库管理系统v 11.0(Reference Manager v 11.0)。Reference Manager是一个专门设计来管理书目参考文献的资料库程序。收集参考文献

19、和制作书目都可以使用Reference Manager轻易地管理资料。功能强大兼容Word 2003，可在线查找，能自动插入Word，并自动生成所定格式的参考文献。它可以完成下列甚至更多的工作：快速地从草稿中准备格式化的内文引用文献和参考书目，建立并维护部门的研究资料库，追踪再版馆藏，从不同的参考文献来源收集参考文献。目前提供新资料库可以将您收集完成的Reference Manager资料库放在网络环境中，可以通过网络进入您的Web Publisher网站检索并建立参考文献清单或输出参考文献。,2 实验设计与实施,本阶段包括限制酶分析、引物设计、同源序列比较、质粒作图、结构域(motif)查找

20、、RNA二级结构预测、蛋白二级结构分析、克隆策略图谱、三维结构显示、电泳条带定量分析、数据统计分析作图等方面的内容,2.1 引物设计、酶切分析、基序分析,在众多相关软件中首推Primer Premier 5.0，它是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件，利用它的高级引物搜索、引物数据库、巢式引物设计、引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物。该软件主要由以下5个主要功能板块组成：GeneTank 序列编辑、Primer 引物设计、Align 序列比较、Enzyme 酶切分析、Motif 基序分析。有如下功能：种间交叉引物设计、病理检测引物设计、等位基因特效引物设计。可简单

21、地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，并同时显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。也可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来，操作非常简单,2.2 序列的同源比较（Alignment）、进化树绘制,MEGA 3强调了序列获得和演化分析的整合，该软件允许多种格式数据输入，用户可以在多个窗口检视结果，进行序列数据的操作和编辑、系列比对和系统发育关系树推断，并进行演化距离估计。结果输出窗口允许使用者进行浏览、编辑、总结和输出结果。MEGA3.1还包括距离矩阵、系统发育关系展示窗口，以及一些用于直观呈现输入数据和输出结果的高级图形模块，内嵌了稳定的、可进行多

22、序列比对的 CLUSTAL 软件。结果可以直接粘贴到Word上，还能联机的Web数据库检索，是很好用的分子进化遗传分析软件，在一些权威文献中经常见到,2.3 质粒绘图,就象限制酶切位点分析一样，也是最常用的功能。好的质粒绘图软件首先能对已知序列自动作图；如果是未知序列，但根据用户已知的质粒信息也能绘出漂亮的图谱来。推荐软件：Gene Construction Kit 2.0。这是一个非常好的质粒构建软件包。与大多数分析的软件不同，它制作并显示克隆策略中的分子构建过程；包括质粒构建，模拟电泳条带；当然还可以质粒作图（有无序列均可）。通过它绘出来的图还可以继续用来构建克隆策略图谱。只是该软件由于功

23、能太强，使用起来也不简单；但它附有详细的使用帮助，认真研究后，应该没有问题。,2.4 RNA二级结构,RNAdraw是一个进行RNA二级结构计算的软件，依据Vienna RNA package V1.1最佳结构或碱基配对性的矩阵算法或热力学曲线算法、M.Zuker和P.stiegler的动力学算法等，进行RNA结构的预测，有较好准确度及速度。它是Windows下的多文档窗口(multipledocument interface)软件，允许你同时打开多个数据处理窗口。主窗口的工具条提供一些基本功能：打开文件、导入文件、关闭文件、设置程序参数、重排窗口，以及即时帮助和退出程序。RNAdraw中一个

24、重要的特征是鼠标右键打开的菜单显示对鼠标当前所指向的对象/窗口可以使用的功能列表。RNA文库（RNA Library）用一种容易操作的方式来组织你所有的RNA数据文件。,2.5 蛋白质二级结构分析,ANTHEPROT 4.5是位于法国的蛋白质生物与化学研究院（Institute of Biology and Chemistry of Proteins）用十多年时间开发出的蛋白质研究软件包。包括了蛋白质研究领域所包括的大多数内容，功能非常强大。使用个人电脑，可以进行氨基酸序列的二级结构预测，motif的寻找，酶切片段的分析，以及转录后的甲基化分析等各种蛋白序列分析与特性预测。更重要的是该软件能够

25、提供蛋白序列的一些二级结构信息甚至可以分析信号肽断点、跨膜区域等，使用户有可能模拟出未知蛋白的高级结构，是为数不多的蛋白分析软件。,2.6 凝胶分析软件,Band leader 3.0提供处理DNA或蛋白分子凝胶电泳图象和从凝胶电泳图象获得相关数据的工具。它可以对电泳图谱进行半定量分析，用扫描仪将拍下来的照片扫进计算机生成WINDOWS图象格式（BMP），然后就可以用本软件操作进行分析。,2.7 三维结构显示,数据统计软件 CurveExpert ELISA标准曲线拟合、及其他各种有关的实验数据分析，都可以应用CurveExpert进行数据分析。它使用非常方便，可以说是实验数据处理的圣手，并且

26、可以生成漂亮的曲线应用到论文之中。,三：分子生物学技术在兽医领域中的应用,核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一,是定性或定量检测特异RNA 或DNA 序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下,双链DNA 之间的氢键被破坏(变性),双链解开成条单链。这时加入异源的DNA 或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性),若异源DNA 或RNA 之间的某些区域有互补的碱基序列,则在复性时可形成杂交的核酸分子。在进行分子杂交技术时,要用一种预先分离纯化的已知RNA 或DNA 序列片段去检测未知的核酸样品。作为检测工具用的已知RNA或DNA 序列片段称为杂交探针(probe)。它常常用放射性同位素来标记。虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史,但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献,在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。而且,随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展,使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。,四：分子生物学在兽医细菌学中的应用,分子生物学在兽医细菌学中的应用,本次课程结束，谢谢欣赏,