分子生物学与临床.ppt
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1、分子生物学与临床天津市第三中心医院刘树业,随着分子生物学技术的发展,聚合酶链反应(PCR)技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断。1.检测临床标本中病原体核酸序列。2.肿瘤基因突变情况。3.遗传性疾病的基因序列。4.人类白细胞表面抗原(HLA)配型。5.法医学方面的鉴定工作。,PCR技术在临床实验室应用的价值,优点:1.灵敏度高,理论上,只要标本中含有一个分子的DNA或RNA就可以作出诊断。2.特异性强,对于一个19核苷酸的引物来说,非特异性配对的概率为419=2.75*1011这表示要与这19个碱基的排列顺序完全相同时需要的基因组DNA片段的最小长度,而人的基因组长度为3*
2、109碱基对,以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。3.可以早期诊断,如在HCV的感染中,第一周内就可以检测出HCV RNA,而抗体的产生一般在第二周以后。,PCR在诊断病原体感染时的优缺点,4.对于体液免疫力低下或使用免疫抑制剂而无抗体产生者,PCR却可以作出明确诊断。5.可以对病原体作定量分析,反映病原体在机体的复制及动力学变化情况。6.可对病原体进行基因分型。指导临床治疗。,不足之处:,1.操作复杂,技术不易被熟练掌握。2.价格昂贵。3.出于敏感性太高,操作步骤多而复杂,即使有极少量的污染也会造成假阳性。4.由于操作复杂,对试剂及实验条件要求严格,稍有差错就会出现假阴性。,几点认识,一.今后
3、仪器和试剂的发展方向:封管、定量及自 动化;二.样品采集方式对PCR很重要,比操作更重要。三.内标作用:操作过程的监控、控制假阴性。四.从核酸提取、扩增到检测,对照与待测标本 同步进行;,五.禁用产物的电泳分析技术。六.探针杂交技术和防污染技术的采用是一大 进步。,一.标本的采集,常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时,应使用一次性密闭容器,如真空采血管。当使用非密闭采样系统时,如尿、分泌物和骨髓的采样,必须注意防止来自采样者皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理,因为玻璃器皿常含有
4、不易失活的RNA酶。最好是热灭菌,250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝,因为肝素是Taq酶的强抑制剂,而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。临床用于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本建议进行抗凝处理,并尽快(3小时以内)分离血浆,以避免RNA的降解。如未作抗凝处理,则抽血后,必须在1小时内分离血清。,二.标本的稳定化处理,用于DNA扩增检测的标本,采集后一般不需特殊的稳定化处理,但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解,因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理,如流行病学调查的现场
5、采样。异硫氰酸胍盐(Guanidine thiocyanate,GITC)可使 DNA酶和RNA酶立即失活,因此在采集标本时,可将标本材料如血清或血浆按14的比例加至含有5mol/L GITC的试管内中,从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后,标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目,上述稳定化处理方法的效果究竟如何,要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。,三.标本的运送,标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本,通常在运送时,应采用不易破
6、碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本,如果未经稳定化处理,则必须速冻后,放在干冰中运送。,四.标本的贮存,临床体液标本如血清/血浆等可于-70下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10 mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓冲液()中4保存,用于 RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20即可。用 GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。,五.标本的处理(核酸提取),标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤,在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前,应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常,核酸
7、制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致,抑制物可能来源于标本本身(如血红素及其前体或降解产物)或核酸提取过程中残留的有机溶剂(如酚、氯仿等),这些物质对其后的Taq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用,从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时,则必须先进行液化处理,再提取核酸。需注意的是,液化时不能加热,液化时间不能过长。此外,当靶核酸为RNA时,逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理(血清或血浆按14的比例加至含有5mol/L GITC的试管内中,从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活)及核酸提取试剂的RNA酶的污染。对于前者,要核查测定分析前的步骤,如果发现有RNA降解
8、的证据,实验室则应拒绝接受标本,要求重新采取标本,并对运送者给以详细的指导。对于后者,建议使用高质量的商品核酸提取试剂。,一.内源性物质(影响因子),1.类风湿因子2.补体3.嗜异性抗体4.嗜靶抗原的自身抗体5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体6.交叉反应物质7.标本中其它成分的影响,二.外源性物质,1.标本溶血2.标本受细菌污染3.标本保存不当4.标本凝集不全5.标本管中添加物质的影响,PCR测定的临床应用及测定结果的临床意义,结核分支杆菌病原学:结核分支杆菌复合群(MTBC):人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌、非洲型结核分支杆菌和田鼠型结核分支杆菌,后者无致病性。对人有致病性的主要是人型结
9、核分支杆菌,牛型引起人类发病已很少见。此外分支杆菌报道有100余种,1994年国际公认有56种,常用非结核分支杆菌(NTM)或其他分支杆菌(MOTT)的名称。培养:15-20小时一代,2-4周 看到 培养基上的菌落。抗菌治疗后需4-8周或20周才出现菌落。,引物设计:结核分支杆菌共有的靶序列:65KD人型结核分支杆菌特异的靶序列mpt40MTBC特有的靶序列,如IS6110插入序列rRNA序列,以16S-rRNA为模板cDNA扩增,高度保守,TB有高达1000-10000拷贝数,具很高的灵敏度和特异性。注意问题:标本处理痰、胸腹水:液化剂,红细胞裂解液,临床应用评价:Tb 与其他分支杆菌区别:
10、AIDS 鸟分支杆菌,龟分支杆菌TB 耐药基因含菌量较低标本分离TB敏感性:远高于直接涂片和培养 涂片镜检:10000-100000菌/ml,培养:10-100个活菌PCR:1-20 个结核杆菌,但不能鉴别死菌和活菌,不能反映抗结核治疗的效果;还可见临床无结核病证据涂片和培养均阴性而PCR阳性的情况,这在理论上可诊断结核,但临床上很难被医师认同,这涉及所谓金标准的问题,目前还远不能就此情况下PCR阳性的生物学意义和价值作出评价。,沙眼衣原体Chlamydea trachomatis Ct,病原学:三个生物变种:沙眼生物变种A-K12个血清型性病淋巴肉牙肿变种LGV3个血清型,人是天然宿主鼠生物
11、变种鼠是天然宿主,不侵犯人,与鼠肺炎有关病原学检验:涂片、抗原抗体检测、核酸检测,四种衣原体的性状比较,PCR:16SrRNA基因高度保守衣原体属特异引物7.5kD 质粒及MOMP(主要外膜蛋白)基因适于构建种或型特异性引物根据沙眼衣原体内源性质粒序列设计合成的一对引物:1:GGACAAATCGTATCTCGG;2:GAAACCAACTCTACGCTG.扩增片段517,可扩增15个已知血清型的沙眼衣原体.实验证明,此引物不扩增其他眼部常见微生物和正常人核酸,而对临床49例诊断为沙眼的标本阳性率为63%,敏感性和特异性均超过细胞培养法和免疫荧光法与酶免疫法等常规方法,灵敏度达到能检出1个衣原体D
12、NA分子.,特别要注意的问题:取材:一定要取到细胞临床评价:金标准培养免疫学:荧光主观判定 EIA金葡、链球菌、淋球菌-交叉 反应 PCR:假阴阳性,人类组织相容性抗原(HLA),组织相容性(主要组织相容性复合体MHC)系统的概念:有I、II、III类I类:HLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-E,HLA-F,HLA-G,HLA-HL等II类:HLA-DR,HLA-DQ,HLA-DP,HLA-DO,HLA-DN,HLA-M,等位点III类:为补体系统C2,C4,Bf等。HLA抗原的分类:I 类和 II 类抗原多态性、共显性遗传:已发现的HLA基因位点(等位基因数)约400左右,HLA分型
13、的基本方法血清学方法:基本原理活的淋巴细胞表面有大量的HLA-A,HLA-B,HLA-C HLA-DR抗原,在与特异性的同型抗体结合后,有补体存在时会被杀死,经过染色,根据淋巴细胞被杀死的百分率,可以决定待测淋巴细胞是否具有某一特异性的抗原.细胞学方法:基本原理检测的抗原属于HLA-DP,HLA-DQ两个位点,如果两种淋巴细胞表面抗原不同,在一起培养,不同抗原互相刺激,淋巴细胞增殖并向母细胞转化;否则,这两种细胞会保持不变。,HLA分型的基本方法常用X射线处理已知HLA-DP,HLA-DQ特异淋巴细胞,失去增殖能力保持刺激能力,与待测淋巴细胞混合培养,若不发生增殖和母细胞化即认为与已知特异性细
14、胞同型,否则为不同型别淋巴细胞.HLA-DR基因分型:(例)序列特异性引物PCR法合成19对引物,21管加公共引物DR型别.,HLA抗原:一.HLAABC抗原:与疾病相关HLAA,B与器官移植的关联没有D的配型意义显著,C无意义.二.HLAD抗原:与器官移植配型相关DR座位上的等位基因数比AB座位上的少,在随机人群中挑选到DR抗原配合的供体要比选择AB抗原配合的供体容易,所以目前器官移植主要做DR配型.,遗传病检测,遗传病是由基因在性细胞的突变引起的一。PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针法对已知突变热点基因检测:PCR-目的基因-膜 杂交 发现突变位点 合成正常及突变寡核苷酸探针一个等位基因
15、有一种ASO探针,要证明待测标本是否属于这一等位基因,要进行一次杂交显示信号的操作,这对于致病基因有多个突变可能性的诊断(地中海贫血在中国有18种突变类型,全球有100多种),操作繁杂甚至不可能.二。PCR扩增特异等位基因在3末端设计突变位点,根据特异性PCR产物出现与否判断突变的存在.,三.限制性片段长度多态性分析突变位点与酶切位点相关 出现新的电泳图谱四.单链构象多态性分析(SSCP)PCR扩增靶DNA;将特异的PCR扩增 产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发
16、现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变,就可以判定该链构象发生改变,进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏,不需要特殊的仪器,适合临床实验的需要.,不足之处.例如,只能作为一种突变检测方法,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外,由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时,再加上其他条件的影响,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先,它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变.
17、Takao,经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变,90%可被SSCP发现,他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外,SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离,并且还可以进一步提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.,UNG酶/dUTP防污染系统,本试剂盒中加入了dUTP以保证PCR只选择性地扩增临床中的靶DNA。UNG酶(尿嘧啶糖基化酶)能识别并催化酶解含有dUTP 的DNA结构,但不会对含有dTTP 的DNA的结构识别并催化酶解。dUTP 不存在于自然的DNA中,只有运用dUTP 替代dTTP的PCR反应之
18、中产生的扩增子中存在。这种dU化的PCR产物与UNG酶一起孵育后使其失去再被扩增的能力,因UNG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖苷键,可去除dU,使无dU的位点阻止TaqDNA聚合酶的延伸。UNG酶可从单链或双链DNA中消除尿嘧啶,而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无作用。UNG酶在正常PCR循环变性一步就可被灭活,所以对含dU的新的PCR产物没有影响。,肿瘤研究中的分子生物学,肿瘤分为:癌,肉瘤,白血病/淋巴瘤癌:90%的人类肿瘤,起源内胚层及外胚层上皮细胞肉瘤,白血病/淋巴瘤起源中胚层细胞,包括肌肉,骨骼,血管,成纤维细胞以及血液和淋巴系统中的循环细胞肿瘤发展的多步性.病毒癌基因
19、:肿瘤病毒:,有致癌能力的DNA病毒:(6个病毒家族)乙肝病毒,猴病毒40,多瘤病毒,乳头瘤病毒,疱疹病毒,痘病毒只有一类RNA病毒致癌反转录病毒肿瘤抑癌基因的发现:Hanis1960年,正常细胞与肿瘤细胞融合杂合体细胞不致瘤正常细胞中具有肿瘤抑制基因产生肿瘤表型的负调节物当杂合体细胞某段染色体丢失后细胞变为肿瘤表型-这段染色体上有重要的肿瘤抑制基因,抑癌基因:P53多种肿瘤.早期发现肿瘤中P53表达增加,认为是癌基因.正常P53基因抑制肿瘤形成,肿瘤中过量表达的是P53基因突变体作为显性抑制物影响P53功能致癌P16,PTP多种抑癌基因WT1肾母细胞癌DCC结肠癌APC家族性腺瘤息肉癌变广义
20、的讲,许多在细胞繁殖中起正常作用的基因,如DNA修复基因,其突变也会导致肿瘤的发生,它们的存在间接地起到抑制肿瘤的作用,临床评价1、假阳性与假阴性2、阳性率与“金标准”3、临床实践是最重要的依据,遗传病诊断,地中海贫血:珠蛋白序列中的的十几种点突变;3-碱基特异的PCR或ASO.地中海贫血:16号染色体珠蛋白序列中基因簇的三种大片段缺失;每条染色体上各有两个紧密连锁的基因,故一对16号染色体上共有四个珠蛋白基因(/)缺失1个基因-+珠蛋白合成障碍性贫血缺失2个基因-0珠蛋白合成障碍性贫血缺失3个基因-HbH病缺失4个基因(全部缺失)-Hb Barts胎儿水肿综合症非缺失型珠蛋白合成障碍性贫血不
21、终止HB constant spring,遗传病诊断,甲型血友病:X-连锁隐性遗传病,(长距离PCR技术)唐氏综合症(21三体):三体形成配子期;智力低下,1/800全基因组分析法:多个具有多态性的位点进行连锁分析。,生物芯片:PCR技术在HLA-DRB1基因配型中的应用:序列特异性引物PCR(SSP-PCR):,基因诊断是指检测感染者体内病毒核酸的有无,或含量多少来进行病原学诊断的一类方法。病毒性肝炎基因诊断包括病毒基因种类及含量、基因分型、亚型和变异及准种等的诊断。甲型肝炎和戊型肝炎无慢性化,且有较好的血清学诊断指标,故一般不需进行基因诊断。HGV和TTV,病毒性肝炎的基因诊断,定性和定量
22、PCR:定性检测主要是用于未知感染者的诊断,确定患者是否感染了肝炎病毒,结果分别报告为阳性或阴性。定量测定:己知感染者的抗病毒治疗时动态观察疗效,结果报告需以量来表示。如高出定量范围上限,则需对标本稀释后再测,低于定量范围下限时,则报告小于copies/ml,不能以阴性形式报告。,病毒性肝炎的基因诊断,肝炎病毒,甲型肝炎病毒与戊型肝炎病毒由消化道传播,引起急性肝炎,不转为慢性肝炎或慢性携带者。乙型与丙型肝炎病毒主要由输血、血制品或注射器污染而传播,除引起急性肝炎外,可致慢性肝炎,并与肝硬化及肝癌相关。丁型肝炎病毒为一种缺陷病毒戊型肝炎病毒(HEV)庚型肝炎病毒(HGV)TT型肝炎病毒(TTV)
23、SEN型肝炎病毒(HSV),甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV),HAV的生物学性状,属小RNA病毒科,直径27nm,无包膜呈20面立体对称外面为一独立外壳,内含一个单链RNA分子,HAV的电镜照片,Feinstone(1973),HAV的结构,HAV的致病性,粪口途径传播,口咽部或唾液腺中早期增殖,肠道与局部淋巴结中大量增殖,入血并形成病毒血症,肝脏为最终靶器官(病毒直接损伤或免疫病理作用),通过胆汁随粪便排出体外,HAV的免疫性,HAV只存在单一的抗原抗体系统,即HAVAg和抗-HAV 无论显性感染还是隐性感染均能诱生出高效价抗-HAV 抗-HAVIgM阳性是甲肝的确
24、诊依据 IgM型抗体在感染后仅持续存于3-6个月IgG型抗体则可存在多年,Time course of HAV infection,HAV的其他生物学特性,培养特性 原代肝细胞或恒河猴胚肾传代株细胞对HAV敏感,生长缓慢,不引起细胞裂解抵抗力 比肠道病毒更耐热,601h不被灭活,100oC 5分钟可灭活 对乙醚、酸处理(pH 3)均有抵抗力 氯消毒、紫外线照射、福尔马林处理均可破坏其传染性,常见症状,流感样症状厌食恶心黄疸(眼部及皮肤呈黄色)尿黄腹痛乏力,微生物学检查,感染早期可检测血清中的抗HAV IgM流行病学调查可检测抗HAV IgG对已接种甲肝疫苗者检测中和型抗HAV抗体直接检测抗原或
25、用分子生物学方法检测病毒RNA,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV),HBV-DNA,病原学:HBV属嗜肝DNA病毒科,部分双链DNA,3200碱基对,10个亚型,序列表明不同亚型的变异为10%,同一亚型的变异为2%。检测:病原体抗原、抗体核酸临床评价:,HBV的基因组结构,3.2Kb不完全双链环状DNA,含4个ORF,可将微孔板包被有蛋白质(如亲和素或链霉亲和素、抗Dig-抗体、牛血清白蛋白)或已知序列的核苷酸,此为通用型活化微孔板,任何探针末端只要含有相应配体或与已知序列互补的核苷酸都可与相应的活化微化板固相化。我们设计了HBV特异探针,其-端含-段与通用板已知序列互
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