分子生物学-蛋白质的翻译.ppt

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1、第八章 蛋白质的翻译,1 遗传密码2 蛋白质合成中使用的RNA3 核糖体4 蛋白质合成中使用的20种氨基酸5 蛋白质合成的生物学机制6 蛋白质合成的抑制7 小 结,重点内容：基本概念：遗传密码、密码子、摇摆假说；遗传密码的性质；核糖体结构组成及几个活性部位生物学功能；原核生物蛋白质合成起始的深刻理解；真核生物蛋白质合成起始时几种复合物变换；原核生物和真核生物蛋白质合成起始性比较；肽链延伸的机理；释放因子终止肽链合成的机理。,1 遗传密码,1.1 两个概念1.2 破译简史1.3 遗传密码字典1.4 遗传密码性质,遗传密码(genetic code):DNA（或mRNA）中核苷酸序列与蛋白质中氨基

2、酸序列之间的对应关系。密码子(codon)：mRNA上每3个相邻核苷酸编码多肽链中一个氨基酸，这三个核苷酸称一个密码子或三联体密码。,1.1 两个概念,（1）1954年Gamow首先对遗传密码进行了探讨；（2）1961年Crick 证明三联体密码子是正确的；（3）1961年，Nirenberg以均聚物、随机共聚物、特定序列的共聚物作模板合成多肽，破译遗传密码；（4）1964年Nirenberg 用核糖体结合技术研究遗传密码，直接测出三联体对应的氨基酸；（5）到1966年，遗传密码全部破译。,1.2 遗传密码破译简史,核糖体结合技术,保温,硝酸纤维滤膜过滤,分析留在滤膜上的核糖体-AA-tRNA

3、,确定与核糖体结合的AA和模板,特定三核苷酸为模板+核糖体+20 种AA-tRNA(其中一种AA-tRNA的氨基酸被14C标记）,1.3 遗传密码字典,1.4 遗传密码的性质,1.4.1 简并性与兼职性 简并性：许多氨基酸对应的密码子不止一种。兼职性：AUG（Met)和GUG（Val)两个密码子除代表特定氨基酸外，还兼作起始密码子。,Amino acids have 1-6 codons each,1.4.2 普遍性与特殊性,普遍性：遗传密码无论在体内还是体外，无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都通用；特殊性：遗传密码的个例很少见；基因组中编码含义的改变常涉及到对终止密码子的解读；密码子系统

4、性改变只存在于线粒体中。,Changes in the genetic code usually involve Stop/None signals,1.4.3 密码子-反密码子识别的摇摆性,在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，而第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”。,Third bases have least meaning,密码子与反密码子的识别,在密码子第三位碱基与反密码子第一位碱基之间，碱基配对的摆动允许形成G-U配对。,G-U pairs form at the third codon base,Anticodon 3 G-C-I G-C-I G-C-I 5C

5、odon 5 C-G-A C-G-U C-G-C 3,I:次黄嘌呤,1.4.4 读码的连续性,生物合成过程中，mRNA的编码方向是53，从N端向C端延伸肽链。一条肽链合成起始后，密码子按3个一框读下去不重叠也不跳格，直到终止。,2 蛋白质合成中使用的RNA,概 述2.1 mRNA2.2 tRNA2.3 rRNA,mRNA：蛋白质的DNA序列信息的中间体。tRNA：运送特定氨基酸到核糖体上合成蛋白质。rRNA：核糖体的组成元件。,概 述,2.1 mRNA,2.1.1 原核生物mRNA与真核生物mRNA结构比较,核糖体可以不从mRNA上解离连续合成三个蛋白质,2.1.2 原核生物mRNA与真核生物

6、mRNA生命周期比较,2)The life cycle of Eukaryotic mRNA messenger RNA:expression of mRNA in animal cells requires transcription,modification,processing,nucleocytoplasmic transport,and translation.,Eukaryotic mRNA is modified and exported,2.2 tRNA,2.2.1 tRNA的基本结构,tRNA折叠为紧凑的L型三级结构。,tRNA is an adaptor,2.2.2 tRN

7、A的生物学功能,tRNA特异性只取决于反密码子,与携带的氨基酸无关P111,2.2.3 tRNA的分类,（1）起始tRNA和延伸tRNA：一类能特异识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA；其它tRNA称为延伸tRNA。（2）同工tRNA:代表相同氨基酸的tRNA称同工tRNA。（3）校正tRNA：通过tRNA中反密码子改变来校正密码子突变，使其在突变位点引入正确氨基酸。无义突变(nonsense mutation):指DNA上任何代表氨基酸的密码子变为终止密码子的改变。错义突变(missense mutation):指DNA分子中的核苷酸置换后改变了mRNA上遗传密码，从而导致合

8、成的多肽链中一个氨基酸被另一氨基酸所取代的改变。,3.1 核糖体的基本结构3.2 核糖体在细胞中的占有比例3.3 核糖体的生物学功能,3 核糖体,/80S,/40S,/60S,3.1 核糖体的基本结构,Size parisons show that the ribosome is large enough to bind tRNAs and mRNA.,Ribosomes are large ribonucleoprotein particles that contain more RNA than protein and dissociate into large and small sub

9、units.,细胞器核糖体：与胞质中的存在明显差异，并具不同形式。有时与细菌核糖体大小相当（70%rRNA），有时仅60 S（30%rRNA）核糖体存在于每个进行蛋白质合成的细胞中。虽然在不同生物内其大小有别，但组织结构基本相同，而且执行的功能也完全相同。,NOTE：,3.2 核糖体在细胞中的占有比例,3.3 核糖体的生物学功能,mRNA结合部位；结合AA-tRNA部位（A位）；结合肽基 tRNA部位（P位）；空载tRNA移出部位（E位）；形成肽键的部位。此外，还有用于起始和延伸的各种蛋白质因子结合部位。,核糖体发挥生物学功能的5个基本部位,大小亚基的生物学功能,小亚基：通过密码子与反密码子的

10、配对，识别并结合模板mRNA，蛋白质合成中A位、P位、E位的一部分等。大亚基：结合多肽链，催化肽键形成、蛋白质合成中A位、P位、E位的一部分等。,Ala（A）Val（V）Leu（L）Ile（I）Pro（P）Met（M）His（H）Gly（G）Ser（S）Thr（T）Cys（C）Phe（F）Trp（W）Asp（D）Glu（E）Lys（K）Gln（Q）Arg（R）Tyr（Y）Asn（N）,4 蛋白质合成中使用的20种氨基酸,5 蛋白质合成的生物学机制,5.1 氨基酸活化 5.2 基本过程 5.3 蛋白质合成起始 5.4 蛋白质合成延伸 5.5 蛋白质合成终止,5.1 氨基酸活化,5.1.1 氨酰-

11、tRNA合成酶的生物学功能5.1.2 氨酰-tRNA合成酶引入的两种错误,5.1.1 氨酰-tRNA合成酶的生物学功能,总反应：aminoacyl-tRNA synthetase AA+tRNA+ATP AA-tRNA+AMP+PPi 实际反应：第一步：AA+ATP+E E-AA-AMP+PPi第二步：E-AA-AMP+tRNA AA-tRNA+E+AMP AA:amino acid;AA-tRNA:aminoacyl-tRNA E:aminoacyl-tRNA synthetase,An aminoacyl-tRNA synthetase charges tRNA with an amino

12、 acid,The charging reaction uses ATP,它可将tRNA和氨基酸进行分类。每一种氨酰-tRNA合成酶识别一种氨基酸和所有能装载该氨基酸的tRNA。,关于氨酰-tRNA合成酶,蛋白质合成真实性主要决定于：tRNA能否把正确的氨基酸放到新生多肽链的正确位置。氨酰-tRNA合成酶会引入两种错误：一种是将错误的氨基酸加在正确的tRNA上；另一种是将正确的氨基酸加在错误的tRNA上。前者现错的可能性更大。,5.1.2 氨酰-tRNA合成酶引入的两种错误,Error rates differ at each stage of gene expression,5.2 蛋白质合

13、成的基本过程,5.2.1 tRNA和mRNA的行进路线5.2.2 核糖体活性部位5.2.3 蛋白质合成的三个阶段5.2.4 蛋白质合成中核糖体循环,5.2.1 tRNA和mRNA的行进路线,5.2.2 核糖体活性部位,核糖体有三个tRNA结合位点：氨酰-tRNA进入A位（除用于起始的那个）肽酰-tRNA和起始氨酰-tRNA进入P位 去氨酰-tRNA通过E位脱出肽链从P位肽酰-tRNA上转移到A位氨酰-tRNA上，这样一个氨基酸就被加到肽链上。,5.2.3 蛋白质合成的三个阶段简介,Initiation 30S subunit on mRNA binding site is joined by

14、50S subunit and aminoacyl-tRNA binds,Elongation Ribosome moves along mRNA，extending protein by transfer from peptidyl-tRNA to aminoacyl-tRNA,Termination Polypeptide chain is released from tRNA,and ribosome dissociates from mRNA,5.2.3 蛋白质合成的三个阶段简介,5.2.4 蛋白质合成中核糖体循环,I：游离核糖体可解离为不同亚基；II：合成起始并非完整核糖体所为；II

15、I：细菌核糖体以70S复合体形式延伸。,核糖体循环与蛋白质合成,5.3 蛋白质合成的起始,5.3.1 原核生物蛋白质合成起始,5.3.2 真核生物蛋白质合成起始,原核和真核生物蛋白质合成起始比较,5.3.1 原核生物蛋白质合成起始,（1）起始总反应式（2）细菌中三种重要的起始因子（3）起始反应第一个氨基酸及第一个氨酰-tRNA（4）起始密码子的选用（5）起始位点及其实验分析（6）多顺反子mRNA的翻译起始,(1)原核生物起始总反应式：,30S+50S+mRNA+fMet-tRNAf,(2)细菌中有三种起始因子IF-3：稳定30S亚基；辅助30S亚基与mRNA上起始点特异性结合；IF-1：与30

16、S亚基结合在A位，阻止氨酰-tRNA进入；阻止30S与50S亚基结合。IF-2：结合特定起始因子tRNA，控制它进入核糖体；有核糖体依赖GTP酶活性；,Initiation requires factors and free subunits,在细菌和真核生物细胞器中：起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸，与小亚基结合的是氨甲酰甲硫氨酰-tRNA(N-formyl-methionyl-tRNA，fMet-tRNAfMet 或 fMet-tRNAf)，由两步反应合成：第一步：Met+tRNAfMet+ATP Met-tRNAfMet+AMP+PPi 第二步：甲酰基转移酶N10-甲酰四氢叶酸+Met-tRNA

17、fMet 四氢叶酸+fMet-tRNAfMet,（3）起始反应的第一个氨基酸及第一个氨酰-tRNA,甲酰基转移酶,fMet-tRNAf 结构特征,fMet-tRNAf与30S-mRNA复合体结合需IF-2参与。50S亚基结合后，GTP能量被释放，所有IF都被释放。,Initiation is controlled by three factors,30S subunits initiate；ribosomes enongate,(4)起始遗传密码的选用,所有蛋白质合成由同一氨基酸-甲硫氨酸开始。多肽合成起始信号是一个ORF开始的独特密码子。常为AUG。但细菌中也可GUG和UUG。三种密码子被识

18、别的效率不一样：AUG=2 GUG=4 UUG,（5）起始位点及其实验分析,细菌mRNA起始点包括AUG起始密码子及其上游10个碱基处Shine-Dalgarno嘌呤六聚体；在起始过程中，细菌核糖体30S亚基的16S rRNA 3端有一个可与SD序列的互补序列。,The AUG is preceded by a Shine-Dalgarno sequence,(6)多顺反子的mRNA翻译起始,多数多顺反子的翻译独立发生；某些细菌中，mRNA相邻顺反子翻译直接相连，可由一个核糖体翻译。,5.3.2 真核生物蛋白质合成的起始,（1）小亚基查找起始位点（2）起始位点序列特点（3）起始复合体的形成过程

19、,scanning model:Eukaryotic ribosomes migrate from the 5 end of mRNA to the ribosome binding site,which includes an AUG initiation codon.,（1）小亚基查找起始位点,起始位点含一个典型序列:5 NNNPuNNAUGG 3，在AUG前的第三个嘌呤（G或A）以及紧跟其后的G，可十倍地影响翻译效率。,（2）起始位点序列特点,tRNA:起始和延伸Met-tRNA间区别仅在于tRNA本身。Met-tRNAi用于起始而Met-tRNAm用于延伸。起始因子:真核比原核细胞拥有

20、更多起始因子，它们在起始全过程中发挥作用。,（3）起始复合体的形成过程,Eukaryotic initiation uses several plexes,They act at all stages of the process,including 5 stages:1)forming a plex with Met-tRNAi 2)forming an initiation plex with the 5 end of mRNA 3)binding the mRNA-factor plex to the Met-tRNAi-factor plex 4)enabling the riboso

21、me to scan mRNA from the 5 end to the first AUG 5)mediating joining of the 60S subunit.,poly(A)stimulates the formation of an initiation plex at the 5 end.,5.3.3 原核生物和真核生物蛋白质合成起始异同点分析,5.4 肽链的延伸,5.4.1 氨酰-tRNA进入A位5.4.2 肽链从P位转移到A位的氨酰-tRNA上5.4.3 易位使核糖体相对于mRNA移动 不同延伸因子选择性结合到核糖体上使肽链不断延伸,5.4.1 氨酰-tRNA进入A位,

22、除起始子以外的氨酰-tRNA均进入核糖体A位，并受延伸因子（细菌为EF-Tu）的催化(前提是P位有肽酰-tRNA占据)。,EF-Tu recycles between GTP-bound and GDP-bound forms,active,inactive,每个细菌约有70 000个EF-Tu分子（约占总蛋白5%），与氨酰-tRNA分子数接近，意味着大多数氨酰-tRNA存在于三元复合体中。每个细胞约只有10 000个EF-Ts分子。EF-Tu*EF-Ts复合体仅是瞬时存在，EF-Tu可迅速转变为GTP结合形式，再形成三元复合体。,5.4.2 肽链从P位转移到A位的氨酰-tRNA上,新生肽链从

23、P位的肽酰-tRNA转移至A位的氨酰-tRNA，这导致肽链延伸；负责肽键形成的催化酶称肽基转移酶（peptidyl transferase)，50S亚基具肽基转移酶的活性；肽键形成使P位产生脱酰基的tRNA，A位产生肽酰-tRNA。,Peptide bond formation takes place by reaction between the polypeptide of peptidyl-tRNA in the P site and the amino acid of aminoacyl-tRNA in the A site.,Nascent polypeptide is transf

24、erred to aa-tRNA,5.4.3 易位使核糖体相对于mRNA移动,核糖体易位使mRNA在核糖体上移动3碱基长度。易位使脱氨酰的tRNA进入E位，肽酰-tRNA进入P位，A位空出。杂合状态模型提出移位分两步进行：50S亚基相对于30S亚基移动，然后30S亚基移动使核糖体构象复原。,The hybrid state translocation model,tRNA moves through 3 ribosome sites,5.4.4 不同延伸因子选择性结合到核糖体上使肽链不断延伸,易位需要EF-G，其结构类似于氨酰-tRNA*EF-TU*GTP复合体，该因子为细胞的主要组分，一个核

25、糖体就约有1个分子。EF-Tu及EF-G与核糖体的结合是相互排斥的。易位需要GTP水解，这引起EF-G的变化，继而又引起核糖体结构的变化。,The structure of the ternary plex of aminoacyl-tRNAEF-TuGTP(left)resembles the structure of EF-G(right).Structurally conserved domains of EF-Tu and EF-G are in red and green;the tRNA and the domain resembling it in EF-G are in pur

26、ple.,EF factors have alternating interactions,Binding of factors EF-Tu and EF-G alternates as ribosomes accept new aminoacyl-tRNA,form peptide bonds,and translocate.,黄色霉素,梭链孢酸,5.5 蛋白质合成的终止,5.5.1 三种终止密码子5.5.2 释放因子5.5.3 肽链合成终止反应过程,5.5.1 三种终止密码子,三个终止密码子（termination codon，stop codon)UAA、UAG和UGA终止蛋白质合成；U

27、AA是最常用的终止密码子。UGA比UAG使用频率高一点，但UGA出错的可能性更大一点。,5.5.2 释放因子,终止密码子是被蛋白质释放因子(release factor，RF)而不是氨酰-tRNA所识别；,（1）原核生物的RF,I型释放因子结构类似于氨酰-tRNA*EF-Tu和EF-G；I型释放因子（RF1识别UAA和UAG，RF2识别UGA和UAA），它们在A位发挥作用（此时P位要有肽酰-tRNA），并水解肽酰-tRNA上的键；释放因子约占核糖体的1/10 II型释放因子(RF3)依赖GTP发挥作用，它协助I型因子；,Several factors have similar shapes,M

28、olecular mimicry enables the elongation factor Tu-tRNA plex,the translocation factor EF-G,and the release factors RF1/2-RF3 to bind to the same ribosomal site.,真核生物I型释放因子eRF1是一个识别全部三种终止密码子的单体蛋白质，其序列与细菌的释放因子有同源性。但eRF3是一种在酵母体内翻译中必需的释放因子。,（2）真核生物的RF,The eukaryotic termination factor eRF1 has a structur

29、e that mimics tRNA.The motif GGQ at the tip of domain 2 is essential for hydrolyzing the polypeptide chain from tRNA.,Peptide transfer and termination are similar reactions in which a base in the peptidyl transfer center triggers a transesterification reaction by attacking an N-H or O-H bond,releasi

30、ng the N or O to attack the link to tRNA.,5.5.3 肽链合成终止反应过程,6 蛋白质合成的抑制,蛋白质生物合成的抑制剂主要是一些抗生素。如嘌呤霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素等，此外，如5-甲基色氨酸、环己亚胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖体灭活蛋白等都能抑制蛋白质合成。,抗菌素对蛋白质合成的抑制机制：（1）阻止mRNA与核糖体结合(氯霉素)；（2）阻止AA-tRNA与核糖体结合(四环素类)；（3）干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读(链霉素、新霉素、卡那霉毒等)；（4）作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成（嘌呤霉素）。,几种常见蛋白质合成抑制剂的结构式,嘌呤霉素抑制蛋白质合成的分子机制,注：青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白合成，影响细胞生长。,7 小 结,