分子发光分析法修改.ppt

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1、2023/9/23,第八章 分子发光分析法,一、分子荧光(MF)分析法 二、分子磷光(MP)分析法 三、化学发光分析法,Molecular Luminescence Spectrometry,MLS,2023/9/23,第七章 分子发光分析法,2023/9/23,第七章 分子发光分析法,2023/9/23,第七章 分子发光分析法,一、分子荧光与磷光产生过程二、激发光谱与荧光光谱三、荧光的产生与分子结构关系四、影响荧光强度的因素,第一节 分子荧光与磷光,2023/9/23,基态分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)，电子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态时发射电磁辐射(即光)的形式释

2、放能量，就称为“发光”。M+能量 M*M+热量 M+h 分子吸收了光能而被激发，跃迁至振动能级的三重态或单重态，回到基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。M+h M*M+h 荧光和磷光属于光致发光。,一、荧光与磷光的产生过程,2023/9/23,一、荧光与磷光的产生过程,依据分子结构理论讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁 分子发光属于分子发射光谱的范畴，光发射过程涉及分子内部电子能级的跃迁。基态(S0)激发态(S1、S2.)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式,速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。第一、第二、电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、

3、电子激发三重态 T1、T2。,2023/9/23,2.电子激发态的多重度,电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)。平行自旋比成对自旋稳定（洪特规则），因此，在同一激发态中，三重态能级比相应单重态能级低。大多数有机分子的基态处于单重态。,S0T1 禁阻跃迁；通过其他途径(系间跨越)；进入的几率小。,2023/9/23,外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,2023/9/23,3.激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁(热)等方式失去能量。,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧

4、光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s,第一激发三重态的最低振动能级基态。,2023/9/23,辐射能量传递过程,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态各振动能级(为 S1 S0跃迁)，发射波长为 2的荧光；发射时间约为10-710-9 s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小,波长长。磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态各振动能级(T1 S0跃迁)。发光速度很慢：10-4100 s。光照停止后，可持续一段时间。电子由S0进入T1的可能过程：（S0 T1禁阻跃迁）S0 激发态振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫 T1,2023/9/23,二

5、、荧光(磷光)激发光谱与发射光谱,1.激发光谱 固定发射波长(选最大发射波长),扫描激发波长，可获得化合物发射的荧光(磷光)强度与激发波长的关系曲线。,荧光和磷光均属于光致发光，都涉及到两种辐射，即光的吸收和发射，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。,通过激发光谱，选择最佳激发波长发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用ex表示。,2023/9/23,2.发射光谱,固定激发波长(选最大激发波长),扫描发射波长，可获得化合物发射的荧光(或磷光)强度与发射波长关系曲线。,通过发射光谱选择最佳的发射波长发射荧光(磷光)强度最大的发射波长，常用em表示。,2023/9/23,3.荧光光谱

6、的基本特征,a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长。产生原因：激发态分子由于振动弛豫及内部转移的无辐射跃迁，是产生位移主要原因；荧光发射时，分子基态不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级，也造成能量的损失；外转换。,2023/9/23,3.荧光光谱的基本特征,b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态各振动能级，产生波长一定的荧光(如2)。c.荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样

7、）成镜像对称关系。可由荧光发射光谱和吸收光谱的成因来解释。,2023/9/23,镜像规则产生原因：,(b)基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布是相似的。,(a)激发光谱(吸收谱)的形状表明了分子第一激发单重态的振动能级结构，荧光光谱(发射光谱)表明了分子基态的振动能级结构。,2023/9/23,镜像规则产生原因：,(c)根据Frank-Condon原理，电子跃迁过程中核的相对位置不变（近似的），若吸收光谱中某一振动带的跃迁几率最大，则在荧光发射光谱中，其相反跃迁的几率也应最大(说明高峰对高峰，低峰对低峰）非镜像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质存在。,基于上述原因，荧光发射光谱

8、与吸收光谱之间显现镜像对称关系。,2023/9/23,200,250,300,350,400,450,500,荧光激发光谱,荧光发射光谱,nm,蒽的激发光谱和荧光光谱,2023/9/23,三、荧光的产生与分子结构的关系,1.分子产生荧光必须具备的条件,（1）具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚性结构 的有机分子；（2）具有一定的荧光量子产率。,荧光量子产率（）：衡量荧光物质发光能力。它表示激发分子发射出荧光(或磷光)的比例,或,2023/9/23,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：,荧光发射过程的速率常数，取决于分子结构。,各种无辐射

9、跃迁过程的速率常数之和。取决于分子所处的化学环境，同时也与化学结构有关。,磷光的量子产率p与荧光量子产率p相似。,2023/9/23,2.化合物的结构与荧光,（1）跃迁类型：大多数能发荧光的化合物都是由*或n*跃迁激发，然后经过振动弛豫等无辐射跃迁，再发生跃迁而产生荧光。其中*跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。,（2）共轭效应：发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有共轭双键(键)的结构体系。共轭体系越大，电子的离域性越大，越容易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光(或磷光)峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。,2023/9/2

10、3,几种线状多环芳烃的荧光,2023/9/23,（3）刚性平面结构：刚性平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，减少能量的外部损失，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,2023/9/23,（4）取代基效应（实验总结和推测）：取代基的性质(尤其是生色基团)对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。,给电子取代基使荧光加强供电子基团的有-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN等。,取代基的影响主要有以下几个方面：,吸电子基团使荧光减弱而磷光增强属于这类基团的为吸电子基团：如羰基(-COOH，-CHO)，硝基(NO2)及重氮基等。,2023/

11、9/23,取代基位置的影响 取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位，对位取代者增强荧光，间位取代者通常抑制荧光。取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影响。,2023/9/23,重原子效应：荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。芳烃这种效应称为“重原子效应”。所谓重原子取代，一般指的是卤素(Cl、Br和I)原子取代。由于重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，使得荧光体中的电子自旋-轨道耦合作用加强，系间跨跃显著增加，结果导致荧光强度减弱，磷光强度增强。,2023/9/23,四、影响荧光强度的因素,外部因素1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光

12、发生变化；,2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。低温荧光分析受到重视。,荧光发射的主要电子跃迁类型*跃迁，溶剂极性增大，荧光光谱发生红移，而且荧光增强。,不同温度下邻菲啰啉在邻二苯中的荧光光谱,2023/9/23,3.溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。,2023/9/23,4.内滤光作用和自吸现象,自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。,内滤光作用：溶液中含有能吸收荧光物质发射的荧光的组分，如色胺酸中的重铬酸钾；,2023/9/23,5.荧光猝灭,荧光分子与溶剂分子或者其他分子之间

13、存在相互作用，使得荧光强度降低或消失的现象。,（1）碰撞猝灭碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。,激发单重态的荧光分子,猝灭剂分子,2023/9/23,生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，是指基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。,（2）生成化合物的猝灭,基态的荧光物质,猝灭剂,（3）氧的猝灭,O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。,2023/9/23,4.荧光物质的自吸猝灭,当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。,自猝灭可能有如下

14、几个原因：(1)荧光物质分子之间的碰撞能量损失;(2)荧光物质的自吸收;(3)荧光物质分子的缔合。,2023/9/23,第五章 分子发光分析法,一、仪器与结构流程二、荧光分析法和应用三、磷光分析法的应用,第二节 分子荧光与磷光分析法,2023/9/23,Cary Eclipse 荧光分光光度计荧光、磷光化学/生物发光美国瓦里安技术中国有限公司,2023/9/23,一、仪器结构流程,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,2023/9/23,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理仪器控制,发射单色器,

15、1.荧光光度计仪器光路图,2023/9/23,光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见-紫外区),光源要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命,高压汞灯:是以汞蒸气放电发光的光源，一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源。氙灯:是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，具有光强度大，在200800nm 范围内是连续光源的特点。染料激光器:是一种新型的荧光激发光源。,2023/9/23,I0,It,IF,p,检测器：,现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。,样品池：,荧光分光光度计的样品池四面透光。,单色器：荧光分析仪中应用最多的单色器为

16、光栅单色器，光栅有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。在比较低档次的荧光计中，采用滤光片作为单色器。,2023/9/23,2.定量依据与方法,(1)定量依据 荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光量子效率：,由朗伯-比耳定律得：,荧光强度 If：,2023/9/23,对于稀溶液，当 bC 0.05（磷光 bC 0.01）时：,If-荧光强度I0-入射光强度f-荧光量子产率b-吸收光程-摩尔吸光系数C-物质浓度,Ip-磷光强度I0-入射光强度p-磷光量子产率b-吸收光程-摩尔吸光系数C 物质浓度,2023/9/23,（2）定量方法,

17、标准曲线法：,直接荧光标准曲线法,荧光熄灭工作曲线法,比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。,2023/9/23,3.荧光分析法的应用,(1)无机化合物无机化合物荧光分析有直接荧光法、荧光猝灭法、间接荧光法及催化荧光法等。,（a）直接荧光法 待测元素与有机试剂所组成的能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。,（b）荧光猝灭法 某些元素虽不与有机试剂组成会发荧光的配合物，但可以从其他会发荧光的配合物中取代金属离子或有机试剂，组成更稳定的不发荧光配合物或难溶化合物，而导致溶液荧光强度的降低，由荧光强度降低的强度来测定该元素的含量。,2023/9/23,(2)有

18、机化合物和生物 具有荧光特性的有机化合物，生物、药物化合物可直接采用逆光荧光分析法测量。,目前研究热点：激光诱导荧光研究溶液中单分子行为；荧光分子作为探针研究DNA。,（c）间接荧光法 间接荧光法常用于某些阴离子如F-、CN-等的分析，它们可以从某些不发荧光的金属有机配合物中夺取金属离子，而释放出能发荧光的配位体，从而测定这些阴离子的含量。,2023/9/23,磷光分光光度计,光学系统与荧光分光光度计的区别,样品池与荧光分光光度计的区别,盛液氮的石英杜瓦瓶。,利用荧光和磷光发射寿命的差别,磷光发射，因其平均寿命较长，碰撞去激发的效应更大，所以常采用低温磷光或固体磷光方法。,2023/9/23,

19、二、磷光分析法的应用,1.稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表2.农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01 g/cm-3 3.药物分析和临床分析 见表,2023/9/23,2023/9/23,2023/9/23,第五章 分子发光分析法,一、基本原理二、化学发光分析的特点三 装置与技术,第三节 化学发光分析法,2023/9/23,一、化学反应发光基本原理,某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应热，而使反应产物分子激发到激发态，受激分子由激发态去激化跃迁回基态时以辐射形式发射出一定波长的光。这种

20、吸收化学能使分子激发并发光的过程，称为化学发光。利用化学发光建立起来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光也发生在某些生物体系内，称为生物发光。,2023/9/23,一、化学反应发光基本原理,化学发光反应的类型(1)直接化学发光 A+B C+D*D*D+h(2)间接化学发光A+B C+D*D*+F F*F*F+h,2023/9/23,化学发光反应包含有化学激发和发光两个关键过程，它必须满足下列条件：,(1)激发能的主要来源是反应焓，化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应焓相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；(2)化学反应历程使反应产生的化学能用于不断地产生激发态分子；(3)

21、激发态分子跃迁回到基态时，以光辐射为主，具有很高的量子产率。,2023/9/23,2.化学发光效率,化学效率：,发光效率：,又称为化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。定义为:,2023/9/23,3.化学发光强度与化学发光分析的依据,化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。每一个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不同的化学发光效率。,化学发光强度ICl即单位时间内发射的光子数，可以下式表示:,式中 表示t 时刻的化学发光强度，是与分析物有关的化学发光效率，dc/dt 是分析物参加反应的速率。,化

22、学发光强度,2023/9/23,3.化学发光强度与化学发光分析的依据,在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性，通常采用峰值光强度进行定量。,在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(A)，其与被测物浓度成线性：,2023/9/23,4.化学发光反应的类型,（1）气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应 NO+O3 NO2*NO2*NO2+h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 O2+O（1000 C石英管中进行）SO2+O+O SO2*+O2 SO2*SO2*+h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；,20

23、23/9/23,（2）火焰中的化学发光反应,在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮 NO+H HNO*HNO*HNO+h 发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：690nm；在富氢火焰中：NO2+2H NO+H2O 该反应十分迅速；,2023/9/23,b.硫化物,挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2+2H2 S+2H2O S+S 2S2*S2*S2+h 发射光谱范围：350460nm；最大发射波长：394nm；灵敏度：0.2 ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。,2023/9/23,

24、（3）液相中的化学发光反应,机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。,2023/9/23,5.化学与生物发光分析的应用,（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至 10-

25、9 mol/L 的H2O2；（3）间接测定某些生物试样,氨基酸+O2 酮酸+NH3+H2O2,氨基酸氧化酶,葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖酸+H2O2 通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。,葡萄糖氧化酶,2023/9/23,草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。,2023/9/23,生物发光分析应用,在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸

26、盐(ppi)：,ATP+LH2+E+Mg2+AMP LH2 E+Mg ppi+2H+,pH7-8,复合物与氧反应，产生化学发光：,AMP LH2 E+O2 氧化荧光素*+AMP+CO2+H2O氧化荧光素*氧化荧光素+h最大发射波长562nm；,2023/9/23,二、特点,1.灵敏度极高 荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量;2.仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；3.发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；4.线性范围宽5.分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）

27、；机理研究少。,2023/9/23,2023/9/23,三、装置与技术,装置流程：,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大。,2023/9/23,四、化学发光分析的应用,化学发光分析最大的特点是灵敏度高，对气体和痕量金属离子的检出限都可达ngmL-1级。在环境检测中化学发光法比吸收光谱法和微库仑法具有更高的灵敏度，又能进行快速连续分析，因此气相化学发光反应已广泛用于空气中有害物质如O3、氮氧化物、CO、SO2、H2S等的监测。其测定灵敏度可达13ngmL-1。液相化学发光反应，如鲁米诺、光泽精、没食子酸等发光体系可测定天然水和废水中的金属离子。在医学、生物学、生物化学和免疫学研究中，化学发光分析也是一种重要的手段。,