分光光度计的操作.ppt

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1、生物化学基本实验技能训练（二）,721E型分光光度计的原理和使用方法(Spectrophotometry),三峡大学医学院生物化学教研室,实验目的(Purpose),1、掌握721E分光光度计的原理、结构与操 作方法2、学习未知溶液的浓度测定方法3、制作CuSO4标准曲线，并用以求得未知CuSO4溶液的浓度,主要内容(Contents),吸光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习,吸光光度法(Spectrophotometry)的原理,问题：如何测定溶液中某一物质的浓度？提示(酸碱滴定、氧化还原、络合滴定、沉淀等)分光光度法：利用溶液对单色光

2、的吸收度来确定溶液中有色物质的含量 有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度愈大，颜色愈深,光的基本性质,光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。波长()、频率()和光速(c)之间的关系是=c/电磁波谱图人的眼睛能感知的光区称为可见光区(Visible Light)，其波长范围约为380760nm。,图11 电磁波谱,物体的颜色是哪里来的？,物质对光的选择性吸收,物质对光的选择性吸收,结论：物质对光的吸收具有选择性，同一种物质对不同波长的光的吸收能力不同，不同物质对同一波长的光的吸收能力也不同物质所呈现的颜色正是它对不同波长光选择性吸收产生的在人视觉上的反映,溶液的颜色当白光通过某一溶液时，该溶液

3、会选择性地吸收某些波长光而让那些未被吸收的光透射过去，溶液呈现透射光的颜色。被吸收的光与透射过去的光称为互补色光,吸光光度法(Spectrophotometry)的原理,分光光度法：利用溶液对单色光的吸收度来确定溶液中有色物质的含量 有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度愈大，颜色愈深,吸收曲线(absorbance curve)以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸收曲线或吸收光谱。光吸收程度最大处的波长，称为最大吸收波长(maximal absorbance wavelength)，常用max表示。在正常情况下，选用不同浓度的某种溶液，最大吸收波

4、长是固定不变的。,应用：,可作为物质定性、定量分析的依据,光吸收的基本概念,条件：一束平行单色光照射到均匀的、非散射的介质如溶液时,I0=Ia+Ir+It I0为入射光强度(Intensity of the incident light)Ia为吸收光强度(Intensity of the absorbant light)Ir为反射光(Intensity of the reflecting light)It为透射光强度(Intensity of the transmitted light),透光率(T)与吸光度(A),透光率(Transmittance，T)T=It/I0100 透光率的变化范围

5、：?吸光度(absorbance，A)：透光率的负对数，又称为光密度(Optical density，OD)A=-lgT=lg(I0/It)吸光度的变化范围：?,Lambert-Beer定律(Lambert-Beers Law),条件：单色光，稀溶液,光吸收基本定律,Lambert-Beer定律(Lambert-Beers Law),液层厚度(path length),数学表达式：,光吸收基本定律,吸光系数是物质的特征性常数,(absorptivity coefficient),(analyte concentration),Lambert-Beer定律的偏离(Limitations of t

6、he Lambert-Beers law),偏离的原因物质浓度太高，改变了被吸收光的折射率。仪器的局限性:入射光、杂散光、吸光度读数（）非对称的化学平衡因其浓度、pH、溶剂和温度的改变，发生解离、缔合、溶剂化和互变异构等化学变化而发生偏离。,吸光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习,仪器结构：,分光光度计,紫外光(UV Light),可见光(Visible Light),紫外光,可见光,测量条件的选择,入射光波长一般选用被测物质溶液的max。可以获得较高的灵敏度控制适当的吸光度测量范围最小误差出现在T%=20-65%(A=0.2-0.7)的

7、范围内 选择适当的参比溶液,参比溶液的选择,a、当被测试液、显色剂及其他试剂在测定波长处都无吸收时 可用纯溶剂(如蒸馏水 distilled water)作参比溶液；b、当被测试液无吸收，而显色剂或其他试剂在测定波长处有吸收时 可用不加试样的“试剂空白”(reagent blank)作参比溶液；c、若被测试液本身在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收时，可用不加显色剂等的“试样空白”(sample blank)作参比溶液。,吸光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习,定量分析方法-1,标准对照法(standard contrast method

8、)根据Lambert-Beer定律得：As=abcs(s=standard concentration)Ax=abcx(x=unknown concentration)cx=Ax/Ascs 标准对照法的优缺点,定量分析方法-2,标准曲线法(standard curve method)配制一系列不同的已知浓度的测定物溶液，按测定管同样处理显色，分别读取各管吸光度以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。测定未知溶液时，按测定管的吸光度即可直接从标准曲线上查得测定物的浓度。标准曲线法的优缺点,定量分析方法-3,摩尔吸光系数法摩尔吸光系数是溶液浓度为1mol/l，液层厚度为1cm的吸光度。在已

9、知的情况下(查文献)，读取测定液厚度为1cm时的吸光度，即可根据下式求得测定液的浓度。C=A/摩尔吸光系数法的优缺点,吸光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习,721E分光光度计(Spectrophotometer)的结构,1电源开关2“波长调节”旋纽3方式设定键（MODE）4.“100%T0A”键 5“0T”键6比色皿架（样品 室）7比色皿架拉杆,功能键介绍 1电源开关2“波长调节”旋纽：设置波长。360-760nm.3方式设定键（MODE）：设置测试方式：T与A4“0T”键：将比色皿架处于“调零透射比”位置。T状态下调T为零。波长不变时

10、无需调“0T”键5“100%T0A”键：使比色皿处于“参比样品”位，用于调整“T为100%”或“A为零”。当波长改变时，须重新调整。6比色皿架：插放比色皿，有4个槽位。7拉杆：推或拉比色皿架拉杆，听到“咔嚓”声时，比色皿已置光路中。第一声“咔嚓”，表示比色皿处于“参比样品”位，第二声“咔嚓”，表示比色皿处于“调零透射比”,仪器预热与调试,开机前，先确认仪器样品室内是否有东西挡在光路上。光路上有东西将影响仪器自检甚至造成仪器故障。1打开电源开关，使仪器预热20分钟。2用“波长调节”旋钮将波长设定在要使用的分析波长位置上。3盖好样品室盖。用“方式设定”键（MODE）改变测试为透光率（T）方式。4调

11、“T=0”：用比色皿选择拉杆使比色皿槽处于“调零透射比”位置，在T方式下，按“0T”键，调透光率为零。5调“T=100”，推或拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“参比样品”位置，按“100%T”调100%透射比。,样品测试,1将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中拿放比色皿时应持其“毛面”不要接触“光面”比色皿内的溶液面高度不应低于1.5cm被测试的样品中不能有气泡和漂浮物比色皿外的液体用滤纸吸干2打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别垂直插入比色皿槽中，盖上样品室盖比色皿的“光面”要与光源在一条线上,垂直放置参比样品通常放在样品架的第一个槽位中3调“T=0”：拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“调零透射

12、比”位置，在T方式下，按“0T”键，调T=04.调“T=100”：将参比溶液推入光路中，用“MODE”键改变测试为“T”，按“100%T0A”键调整T=100/A=0 仪器在自动调整过程中，显示器显示“BLA”，数秒后显示100。5.按“MODE”将测试方式设置为A方式6拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“样品”位，仪器自动显示该样本的吸光度，记录数据。,T handle 0 set T100%：BlankT handle 1 set T 0%：A=1.-A handle2、3、4 assay A：Standard、test1、2Rest state：handle 1 A=1.-,（3）Deter

13、mine,Photometric Mode:Transmittance,T 0%100%Absorbance,A 0 1 Concentration,C,吸光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习,721E分光光度计操作练习,已知CuSO4溶液的浓度5%，测定末知CuSO4溶液的浓度方法 1、利用标准对照法测定 2、制作CuSO4标准曲线，测定未知CuSO4溶液的浓度,操作（Method）,取5只试管，按右表操作混匀，在波长650nm，用蒸馏水(参比溶液）校正零点。读取各管吸光度，记入右表。方法一：以浓度为横轴，吸光度为纵轴，绘制标准曲线。读取未知浓度CuSO4溶液的光密度，从标准曲线上查出其浓度。方法二：以任意一管为标准管，计算未知浓度CuSO4溶液的浓度。,讨论（Discussion）,结合本人的实验结果，分析本实验中的注意事项、误差产生的原因及减少措施。思考题：p17：1、3题,