光谱分析法刘芸.ppt

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1、仪器分析方法分类：,2.电化学分析法:依据物质的电化学性质及其变化,4.质谱法、热分析法、放射化学法等,1.光学分析法:基于电磁辐射与物质的相互作用,3.色谱法:气相色谱法、液相色谱法,1,第三章 光谱分析法,（Spectrum Analysis）,2,本章提要,第一节 光谱分析法概论,第二节 紫外/可见光吸收光谱法,光谱分析法及其特点电磁辐射的基本性质电磁辐射的特性光谱分析法的分类分子光谱法,基本原理紫外/可见分光光度计构造紫外/可见分光光度计类型,3,第三节 分子发光光谱法,光致发光 分子荧光和磷光光谱基本原理 影响荧光强度的因素 分子荧光光谱仪 分子荧光光谱法的应用 磷光光谱法 化学发光

2、法,4,本章提要,第一节 光谱分析法概论,5,是电磁辐射按照波长的有序排列。,光谱(spectrum)：,第一节 光谱分析法概论,6,一、光谱分析法及其特点,光谱分析(spectral analysis)：对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。电磁辐射范围：射线（10-10m）无线电波（103m）所有范围；相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；应用：光谱分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可区代的地位；,7,（1）能源提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生信号。基本特点：（1）所有光分析法均包含三个基

3、本过程；（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。,三个基本过程：,一、光谱分析法及其特点,8,二、电磁辐射的基本性质,电磁辐射（电磁波）：以接近光速（真空中为光速）传播的能量；c=/E=h=h c/c：光速；：波长；：频率；：波数；E：能量；h：普朗克常数 电磁辐射具有波动性和微粒性（波粒二象性）；,9,三、辐射能的特性：,(1)吸收 物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；(2)发射 将吸收的能量以光的形式释放出；(3)散射 由传播介质的不均匀性引起的光线向四周射去；(4)折射 折射是光在两种介质中的传播速度不同；(5)反射 光射到不同

4、的介质介面时，部分光自介面射回原介质中；(6)干涉 干涉现象；(7)衍射 光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象；(8)偏振 只在一个固定方向有振动的光。,10,常用三种光分析法测量过程示意图,11,四、光谱分析分类,光谱分析法,原子吸收,紫外可见,红外可见,核磁共振,紫外可见,红外可见,分子荧光,分子磷光,核磁共振,化学发光,原子发射,原子荧光,分子荧光,分子磷光,X射线荧光,化学发光,12,五、分子光谱法,物质分子内部运动形式及其对应能级1.电子相对于原子核的运动-电子能级;单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反.三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同.2.原子核在其平衡位置附近的相对振

5、动-振动能级;3.分子本身绕其重心的转动-转动能级.,13,分子的能级图与跃迁,Sn:电子能级,Vn:振动能级,Jn:转动能级,分子的总能量=E电子+E振动+E转动,14,分子光谱分析法的分类,分子光谱,分子吸收,分子发光,光致发光,其它发光形式,UV-Vis（紫外-可见）,IR（红外）,如：荧光和磷光,如：化学发光等,15,第二节 紫外/可见光吸收光谱法,16,紫外/可见光吸收光谱分析法：利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长强度变化可进行定量分析。属于分子吸收光谱法，分析波长范围一般为200800nm。,历史悠久、应用广泛：,分析化

6、学药物分析临床检验等,第二节 紫外/可见光吸收光谱法,17,即光吸收基本定律,朗伯定律:(1760)A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的、吸光物质的c 一定时，溶液的吸光度A与液层厚度b成正比。,比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的、液层厚度b 一定时，溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比。,一、基本原理,18,朗伯-比尔定律,意义:当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。,A=lg(I0/It)=kbc,一、基本原理,19,透光率（透射比）T（Transmittance）,A=lg(I0/It)=lg(1/T

7、)=-lgT=kbc,吸光度A（Absorbance）,一、基本原理,20,吸光度A、透射比T 与浓度c 的关系,一、基本原理,21,k 吸光系数（Absorptivity）,（3）当c的单位用g100mL-1表示时，用 表示,A bc，叫做比吸光系数。,一、基本原理,22,吸光度与光程的关系 A=abc,一、基本原理,23,吸光度与浓度的关系 A=abc,一、基本原理,24,吸光度与波长的关系 A=abc,一、基本原理,25,溶液浓度的测定,A b c,工作曲线法(校准曲线),朗伯-比尔定律的分析应用,一、基本原理,26,朗伯-比尔定律的适用条件,1.单色光 应选用max处或肩峰处测定。,3

8、.稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强。,2.吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件(酸度、浓度、介质等)。,一、基本原理,27,吸光度的加和性与吸光度的测量,A=A1+A2+An,用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。,一、基本原理,28,二、紫外/可见分光光度计主要部件,光源,单色器,吸收池,检测系统,分光光度计的基本组成,习惯上将工作波段在200nm800nm的分光光度计称为紫外-可见分光光度计。,优点：通过色散原件（棱镜或光栅）得到一束近似的单色光。波长可调,故选择性好,准确度高。,29,光

9、源（发出所需波长范围内的连续光谱）,可见光区：钨灯，卤钨灯(3202500nm)紫外区：氢灯(180375nm)氙灯、汞灯：紫外、可见光区均可用作光源,要求：有足够的光强度，稳定。,二、紫外/可见分光光度计主要部件,30,31,单色器（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）,二、紫外/可见分光光度计主要部件,32,光栅：（利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光的装置）,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。,优点：波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。,二、紫外/可见分光光度计主要部件,33,检流计（指示器）：低档仪器：刻度显示中高档仪

10、器：数字显示，自动扫描记录,检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。如：光电池，光电管，光电倍增管,吸收池（比色皿）：用于盛待测及参比溶液。,二、紫外/可见分光光度计主要部件,34,1.单光束分光光度计,可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图,三、紫外/可见分光光度计的基本类型,35,2.双光束分光光度计,参比池,检测器,滤光片或单色器,放大器,样品池,光源 hv,光子检测器,反光镜,反光镜,透明部分,扇形镜 正面图,扇形镜,反光镜,栅镜,双光束型可以消除光源强度变化的影响。,可变波长双光束紫外-可见分光光度计示意图,36,第三节 分子发光光谱法,37,分子发光,光致发光,化学发光,生物

11、发光,光致发光（Photoluminescence）:物质当受到光的照射吸收了某种波长的光后，会发射出波长相同或比吸收波长更长的光，这种现象称为光致发光。,Photoluminescence,Molecular Luminescence,Chemiluminescence,Bioluminescence,38,1575年，西班牙医生N.Monardes发现。1852年，George Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。1867年，分子荧光首次用于分析测定。1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。1952年，商品荧光分光光度计出现。,分子荧光技术的发展,39,T

12、he Discovery and Development of the Green Fluorescent Protein,（GFP）绿色荧光蛋白,2008诺贝尔化学奖Osamu Shimomura 1960sMartin Chalfie 1990sRoger Y.Tsiens,today,40,一、分子荧光（磷光）发生的原理,41,。,物质的基态分子受一激发光源的照射被激发至激发态后，电子由第一激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级，以光的形式放出末态两个能级的能量差额称为荧光。基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光谱法。,42,1.分子的多重态：单线态、激发单线态、激发

13、三线态单线态(S0)一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。多数有机物分子的基态是单线态。当基态一对电子的一个被激发到较高能级时，激发单线态(S)自旋方向不改变，分子仍处于单线态。激发三线态(T)有两个电子的自旋不配对而平行的状态。,分子的激发与失活,43,分子的多重态,ET1 ES1 S0T：禁阻跃迁，进入的几率小；,M=2S+1,S:为电子自旋量子数的代数和(0或1)；,电子激发态的多重度：,44,无辐射跃迁振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。系间窜越：同一电子能级激发

14、态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用、能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。,激发态分子的失活,45,辐射跃迁荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106109s-1。磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，寿命较长。,激发态分子的失活,46,荧光与磷光的产生过程,47,图荧光与磷光产生示意图,激发单线态,激发三线态,48,

15、荧光,S1 S0跃迁波长短几率大速度较大寿命短，10-9 10-7s,磷光,T1 S0跃迁波长长几率小速度较小寿命长，为10-4 10s,荧光与磷光的比较,49,二、激发光谱与荧光(磷光)光谱（吸收光谱与发射光谱）,50,1.荧光(磷光)的激发光谱(excitation spectrum)固定测量波长（选最大荧光/发射波长），化合物发射的荧光(或磷光)强度与照射光波长的关系曲线。2.荧光光谱(或磷光光谱)（fluorescence spectrum）固定激发光波长（选最大激发/吸收波长），化合物发射的荧光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线。3.最大激发波长(ex)和最大荧光波长(em),激发光

16、谱与荧光(磷光)光谱,51,室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱,52,激发光谱与发射光谱的关系,53,镜像规则的解释,吸收光谱,荧光光谱,54,镜像规则的解释,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,55,三、影响荧光强度的因素,56,分子产生荧光必须具备的条件：,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如kikf，不出现荧光发射；,荧光的产生与分子结构的关系,（1）具有合适的结构；,57,某些化合物的荧光效率,58,化合物的结构与荧光,具有共轭双键体系的分子,59,（a）萘：荧光效率为0.29；荧光波长为310 nm。,（b）蒽：荧光效率为0.46；荧光波长为40

17、0 nm。,多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定。ex=386 nm em=430 nm,3，4-苯并芘强致癌物!,60,具有刚性不饱和平面结构的分子,化合物的结构与荧光,例,61,反式：平面构型 强荧光体,顺式：非平面构型 非荧光体,例 1，2-二苯乙烯,62,例 金属螯合物,滂铬BBR本身不发荧光,Al3+滂铬BBR发红色荧光,63,苯环上取代基的类型：,化合物的结构与荧光,给电子基团常使荧光增强：-OH、-OR、-NH2、-CN等。吸电子基团会使荧光减弱：-COOH、-NO2、-SH、-X等。,卤素取代基:随着取代基中卤原子系数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。,

18、64,温度：温度越高，荧光降低,环境对荧光的影响,溶剂：极性增加，荧光增强，荧光波长发生红移,pH值：电离平衡的改变导致荧光强度的差异,猝灭剂：动态猝灭、静态猝灭、自猝灭,表面活性剂：保护处于激发单重态的荧光物质分子，提高荧光效率。,65,pH对荧光强度的影响,共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。,离子化后，荧光消失,pH1有荧光,pH13无荧光,66,四、荧光光谱仪,67,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：1.有两个单色器2.光源与检测器通常成直角。,仪器结构,69,荧光

19、光度计光路图,70,荧光分光光度计的的主要部件激发光源：稳定、具有一定强度（300400nm)样品池：低荧光材料，常用石英池，方形检测器：较高灵敏度单色器（激发单色器和发射单色器）：光栅,仪器结构,71,1个光子可产生106107个电子,光电倍增管(Photomultiplier Tube,PMT),72,仪器的使用维护,注意事项电源：触发电压、工作电流、稳定性光源：启动预热、冷却重启、保持清洁单色器：防潮、防尘、防污和防机械损伤光电倍增管：避免高压时受到外来光线直射样品池：插放方向、避免摩擦、清洗个人防护：避免紫外线损伤,73,五、荧光分析方法与应用,74,优点：（1）灵敏度高 比紫外-可见

20、分光光度法高23个数量级；（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少、方法简便、提供比较多的物理参数 缺点：应用范围小。60余种元素，尤其适用于有机物和生物大分子的检测。,荧光分析法的特点,75,荧光信号,荧光寿命荧光光谱荧光强度随光谱变化成像（荧光物质在样本中分布的空间信息）强度寿命,76,可获得的信息,分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等分子浓度信息：荧光强度增强或猝灭分子在溶剂中的状态：荧光光谱的红移或者蓝移，静态或动态猝灭，荧光寿命的变化等等分子间的相互作用：荧光猝灭，荧光寿命，共振能量转移、新的荧光峰的

21、产生分子的大小：分子的转动速度对偏振光的消偏等,77,荧光分析法对物质的定性或定量分析,定性分析：依据不同结构的物质所吸收波长和发射的荧光波长不同；,定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。,78,任何荧光化合物都具有两种特征光谱：荧光激发光谱（吸收光谱）固定某一发射波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱。荧光发射光谱（荧光光谱）固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化得到的光谱。,荧光分析法定性依据,79,(1)定量依据 荧光强度 F正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率f：F=f Ia 由朗-比耳定律：Ia=I0-I=I0(1-10-l c)F=

22、f I0(1-10-l c)=f I0(1-e-2.3 l c)浓度很低（l c 0.05）时，将括号项近似处理后：F=2.3 f I0 l c=K c,荧光分析法定量依据和方法,80,荧光的定量分析,荧光强度与溶液浓度的关系：F=Kc,81,一般当b c 0.05 时,F与c呈线性关系,浓度对荧光强度的影响,82,定量分析方法,标准曲线法比例法解线性方程法,83,标准曲线法,荧光强度,浓度,FX,CX,84,比例法,FS=KCS FX=KCX Fs F0 CS Fx F0 CX CX CS(Fx F0)/(Fs F0),85,解线性方程法,多组分混合物的荧光分析也可以象吸收分光光度法一样利用

23、荧光强度的加和性质，采用解线性方程组的方法、双波长及多波长等方法从混合物中不经分离即可测得被测组分的含量。,86,荧光分析法的应用,单组分的荧光直接测定和间接测定,多组分的荧光测定,87,单组分的荧光直接测定和间接测定,荧光物质,大多数无机和有机化合物,化学反应,荧光猝灭,88,(1)无机化合物的分析 可测量约60多种元素：铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光配合物分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。,单组分的荧光测定,89,(2)有机化合物的分析 芳香族化合

24、物具有共轭不饱和体系，多能发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。胺类、甾族化合物、蛋白质、酶和辅酶、维生素等均可以用荧光法分析。,90,多组分混合物的荧光分析,两组分的荧光光谱峰不重叠：可选用不同的发射波长来测定各组分的荧光强度两组分的荧光光谱峰重叠或接近：可选用不同的激发波长来测定,91,六、磷光光谱法,92,磷光光谱法,磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法。,93,磷光光谱法,磷光光谱分析法的分类,低温磷光,室温磷光,1、固体表面室温磷光法（SS-RTP）2、胶束增稳室稳磷光法（MS-RTP）,94,1.稠环芳烃分析 2.农药、生物碱、植物生

25、长激素的分析 3.药物分析和临床分析,磷光光谱法的应用,95,七、化学发光光谱法,96,基本原理,在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，称为化学发光。,A+B=C+D*D*D+h,97,化学发光的特点,能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；发光持续时间较长，反应持续进行；,98,化学发光的效率,化学效率：,发光效率：,99,时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：,化学发光的效率,100,化学发光分析法定量分析依据：从上式可以看出：发

26、光总强度与分析物浓度成正比。,直接发光A+B C*+D C*C+h,化学发光反应类型,1.直接化学发光和间接化学发光,间接发光A+B C*+DC*+F F*+E F*F+h,2.气相化学发光和液相化学发光,101,灵敏度极高 仪器设备简单 发射光强度测量无干扰 线性范围宽 分析速度快,化学发光分析法的特点,102,内容小结,第一节 光谱分析法概论,光谱分析(spectral analysis)：对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。,（三个基本过程、三个特点）,电磁辐射具有波粒二象性：波动性和微粒性,c=/E=h=h c/,物质分子内部运动形式及其对应能级,光

27、谱分析法分类（吸收光谱法/发射光谱法；原子光谱法/分子光谱法）,内容小结,第二节 紫外/可见光吸收光谱法,定量分析的依据朗伯-比尔定律,A=lg(I0/It)=kbc,（朗伯-比尔定律的分析应用/适用条件）,分光光度计的基本组成,紫外/可见分光光度计的类型,内容小结,第三节 分子荧光和分子磷光光谱法,分子荧光和磷光发生的机理,内容小结,Stokes位移 发射光谱的形状与激发波长无关 镜像规则,激发光谱与荧光(磷光)光谱,荧光的产生与分子结构的关系,内容小结,苯环上取代基的类型,具有刚性平面结构的分子,环境对荧光的影响（温度、溶剂、pH值、表面活性剂、猝灭剂）,具有共轭双键体系的分子,内容小结,

28、荧光光谱仪,检测器,光源,激发单色器,样品池,发射单色器,分类主要部件使用和维护,荧光定量分析,荧光强度与溶液浓度的关系：F=KC,内容小结,荧光定性分析,荧光激发光谱,荧光发射光谱,标准曲线法比例法解线性方程法,分析方法,内容小结,磷光光谱法,荧光分析法的应用,单组分的荧光直接测定和间接测定,多组分的荧光测定,分类、仪器特点及其应用,化学发光光谱法,基本原理、特点、化学发光效率、反应类型,复习思考题,什么叫做光谱分析？其主要过程和特点有哪些？紫外/可见分光光度法的基本原理是什么？紫外/可见分光光度计的主要构造是怎样的？分子的去活化过程有哪些？什么是物质的激发光谱和荧光光谱？二者之间有什么 关系？影响荧光强弱的因素有哪些？分子磷光和化学发光法的特点有哪些？,Thanks!,