传染病血清标志检测指标的发展与应用.ppt
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1、,感染性疾病血清标志物检测的发展与临床应用,传染病血清标志物,1.感染性疾病筛查2.HBV的检测3.HCV的检测4.HIV的检测,感染性疾病筛查,HBV、HCV、HIV等是感染性疾病术前筛查的重要指标2000年卫生部184号文颁发了“临床输血技术规范”的通知,特别强调了手术病人术前的筛查项目,国内感染性血清标志物检测特点,手工操作为主,自动化使用较少检测方法较多,ELISA方法占绝大部分使用仪器和试剂较混乱,试剂多达30几家,仪器多达50多种实验室之间检测结果存在较大差异,酶联免疫法(ELISA)术前病人筛查传统方法,微板法固相载体,优势简单,易操作成本低,缺点包被面积小,反应面积有限颜色反应
2、(灵敏度、特异性)包被均一性不足(精密度)反应时间不一致造成结果偏差(精密度低,熟练的操作人员其批间差也达20%以上)洗板容易带来污染手工操作,管理不易,电化学发光免疫测定(ECL)输血病人筛查自动化方法,方法学对比,传统(ELISA)优点:降低成本可实现自动化缺点:HOOK效应引起的假阳性非特异反应交叉污染引起的假阳性灵敏度低,对于窗口期感染的检出率低,容易导致假阴性的出现,现在(ECL)优点:异相免疫分析,抗原抗体高效结合,无传统一步法的缺点结果稳定,高精密度可控的反应体系快速的检测时间抛弃型tip头避免交叉污染缺点:成本相对较高,传染病血清标志物,1.感染性疾病筛查2.HBV的检测3.H
3、CV的检测4.HIV的检测,乙型肝炎:世界性的公共卫生问题,全球约有20亿人曾感染过乙肝其中3.5亿人为慢性HBV感染者,几乎一半在中国,性传播输血传播围产期传播,医院内传播,乙型病毒传播模式,感染,复制,血清学诊断三步骤,疾病活动期,血清标志物,HBsAg,anti-HBc,anti-HBe,HBeAg,HBV DNA,ALT,HBV疾病的发展,乙肝血清学标记物检测要点,感染后血清转换的早期即可检测出(缩短窗口期)分析灵敏度优异识别所有的亚型可靠地识别病毒变异株高特异性的表现高检测精密度,尤其是cutoff 处精密度表现尤为重要,乙肝表面抗原(HBsAg),1963年由 Blumberg在澳
4、大利亚土著人血中发现,称为澳大利亚抗原(即以前所谓的“澳抗”);又称为肝炎相关抗原(HAA);1974年正式定名为乙型肝炎病毒表面抗原。HBsAg有一个特异的共同抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d/y”和“w/r”,最常见的血清型为adw、adr和ayw。最常用的测定方法为ELISA,使用针对HBsAg的a决定簇的单克隆和多克隆抗体,为双抗体夹心测定模式。血清中检出 HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一 出现时间:HBV感染后26个月(潜伏期),HBsAg检测易出现“假阴性”结果,HBsAg含量低于所用方法的测定下限之下 如感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等。
5、编码HBsAg的HBV S基因的突变。HBV容易发生突变,较其他DNA病毒的突变率要高10倍;S基因发生突变可导致HBsAg的 a决定簇发生改变,最相关的突变是G145R、K141E和T131I以及在122与123位残基之间3个氨基酸的插入,可明显影响HBsAg的抗原结构。丙型肝炎病毒(HCV)与丁型肝炎病毒(HDV)重叠感染对HBV复制和/或HBsAg表达的抑制作用测定方法所用抗体对 HBV不同基因型检测敏感性的不同。,HBsAg 检测的挑战之一:对于低水平HBsAg的检测,HBsAg 是 乙肝感染最早出现的血清学标记物灵敏度 是评价表面抗原的最重要的指标,2006年临床化学杂志 美国华盛顿
6、大学以前在HBV DNA检测方法不是很灵敏度的时候认为HBsAg 阳性而DNA阴性代表病毒的静默期,没有复制;随着更灵敏的DNA检测方法的使用,人们也发现HBsAg阴性而DNA阳性的状况;第一个原因是处于窗口期由于HBsAg的灵敏度决定的,中国低水平HBsAg的状态,浙江大学第一附属医院在2002年做的评估如下:8089例病人中2.34%1ng/ml(17.5%)72例 2ng/ml(38.10%)根据HBsAg II在华西医院的评估结果估计:每100例HBsAg II阳性的标本中,华西的检测方法会漏检5例。,国内外HBsAg诊断试剂灵敏度评估国家参考品adr血清的检测结果,HBsAg 检测的
7、挑战之二:缩短窗口期,与 ELISA 试剂窗口期相差平均20天,HBsAg 检测的挑战之三;对于突变病毒株HBsAg的检测,最常见的HBsAg突变位点,S基因的突变率,1988年意大利研究 2.0%的接种疫苗的人会感染HBV,确认是感染突变病毒株这些患者的血清学表现为表面抗原和表面抗体同时阳性其中最重要的突变是G145R,这个突变可以保持非常高的复制性其中发现的免疫接种的婴儿被感染多是由于这个突变造成的家庭间的水平传播,突变的重要原因,突变原因:自发突变(HBV聚合酶链反应的高出错率)选择性压力下的突变,疫苗接种/高效价免疫球蛋白的应用-疫苗的广泛应用,促使HBV 发生变异的免疫压力逐渐增大,
8、变异的机会增加治疗抑制(拉米夫定),对于突变株无法识别也是漏检的原因之一,HBsAg 检测的挑战之四:不同亚型和基因型的检测,HBV有多个基因型和血清亚型,依据HBV全基因核苷酸序列异源性/8%或者s基因区核苷酸序列异源性/4%为分型标准,HBV可以分为AH的八个基因型。依据HBV的d/y(122-134);a(139-147);w/r(159-160)等决定簇的变化,将HBV分为四个主要的血清亚型不同的亚型可以同属于一个基因型同一个亚型又可以分属不同基因型,可靠地检测HBsAg不同基因型,Elecsys HBsAg II 如何实现能够检测变异株能力?使用了两种单克隆捕捉抗体和一种多克隆信号抗
9、体,罗氏新一代的表面抗原在此评估中没有发现突变漏检,Elecsys HBsAg II性能小结-用于筛查,临床灵敏度高分析灵敏度高0,05IU/ml临床特异性高,可达99.8%血清转化早期检测的灵敏度高可靠的HBsAg 亚型,基因型以及突变的检测能力cut-off附近检测的高精密度,为什么需要 HBsAg定量检测?HBsAg是监控慢性乙型肝炎治疗的指标,对于HBeAg阳性和HBeAg阴性的患者,理想的治疗终点是实现HBsAg的消失(伴随或者不伴随Anti-HBs的出现)。,EASL Clinical Practice Guidelines:Management of chronic hepati
10、tis B,Journal of Hepatology 50(2009),HBV DNA=病毒学标志,HBsAg=免疫学应答标志,HBsAg定量能够对CHB干扰素和核苷类似物的治疗进行监控,Pegasys,Pegasys and NA,NA,干扰素和核苷类似物是目前治疗慢性乙型肝炎的主要两类药物,定量,定量,定量,HBsAg Quant 是监控治疗和判断预后有效工具,Week,0,24,48,Brunetto MR,EASL-AASLD 2008,International Roche Infectious Diseases Symposium 2009,12,Follow-up随访,Pega
11、sys treatment治疗监控,Year,1,2,3,HBsAg Quant,HBsAg Quant,HBsAgIU/ml,HBsAg Quant,HBsAg Quant,HBsAg Quant,HBsAg Quant,HBsAg Quant,在治疗早期HBsAg Quant 比HBV DNA 具有更好的治疗监控价值,Elecsys HBsAg II Quant检测流程,HBsAg II Quant,稀释原始标本,检测范围52000 IU/ml,手工步骤,结果显示(IU/ml),(70%-80%标本在此范围),e411/2010(1:100)e601/e170(1:400)在线稀释,e41
12、1/2010(1:100)e601/e170(1:400)在线稀释,HBsAg II Quant,25的标本,52000 IU/ml,结论,理想的治疗终点是持续的HBsAg的消失。HBsAg是Pegasys治疗预后的良好的指示指标(而不是HBV DNA)。Elecsys HBsAg II quantitative assay可以仪器自动预稀释,并且达到很好的线性范围。60-80%的标本可以一次得到最终结果。,乙肝表面抗体(Anti-HBs),抗HBs是一种中和抗体,其能在体内存在相当长的时间。以HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs,对 HBV的感染具有保护性免疫作用表面抗体(anti-HB
13、s)监控具有重要意义-国际标准 阳性 10U/l;-多国的共识 100 U/l 才具备保护能力-表面抗体定量检测具备溯源性,Anti-HBs 定量检测,乙肝e抗原(HBeAg),HBeAg与病毒Dane颗粒、HBV-DNA具伴随关系,是HBV复制活跃的血清学指标。HBeAg为HBsAg的可溶性成分,通常血清 HBeAg阳性者,其HBsAg亦为阳性。血清HBeAg阳性说明传染性强。急性乙肝患者血清HBeAg持续阳性 3个月以上,则有疾病慢性化倾向HBV抗病毒治疗的重要监测指标。,临床应用急性乙型肝炎早期指标乙型肝炎病毒感染的病人随访高度传染性的标志治疗监控,Elecsys HBeAg,分析灵敏度
14、 用参考材料82做方法比较(100 PEI U/mL),Elecsys HBeAg 灵敏度极佳,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,0,1,2,3,4,5,6,HBeAg concentration PEI U/mL,s/co ratio,Elecsys HBeAgAssay A,cut-off,Elecsys HBeAg 定值溯源性至 PEI 标准品 82,PEI 是 Paul-Ehrlich-Institute 的简称,它是德国的一个机构,隶属于德国卫生部。该机构成立已经100多年,主要的研究方向是疫苗、抗体、基因治疗、变态反应原研究等。它有很多职能,包括德国以及欧
15、盟的医学产品法规的制定;PEI 是的合作组织,只要职能是体外血液产品的质量确认。PEI 还提供以下标志物的参考品和国际标准品:HIV 1/2,HBV,HCV,HAV,Rubella virus and HCMV由于HBeAg没有 WHO标准品,所以目前PEI 标准品是最高级的国际标准品。,稀释灵敏度,Elecsys HBeAg的 COI结果具有半定量的分析能力,0.1,1,10,100,1000,10000,100000,0.1,1,10,100,1,000,10,000,log HBeAg PEI U/mL,log COI,recombinant HBeAg(5g/mL),2300 PEIU
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