《基因工程概论》课件.ppt

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1、基因工程 Genetic Engineering,主讲教师：李黄金Email:任课教师：张文峰、陈伟生命科学与生物制药学院13,自我介绍,98年获理学博士学位，中山大学92-2006年在企业工作“重组人表皮生长因子(rhEGF)衍生物”*国家一类新药(1998)*国家高技术产业化示范工程(2002)*中国药典2005版三部收录品种,第一章 基因工程概述,基因工程与生物技术世纪基因工程的基本概念、原理与过程基因工程的历史基因工程的未来课程结构,一、基因工程与生物技术世纪,人类文明发展的三次技术革命,工业革命 19世纪，解放双手信息革命 20世纪，解放大脑生物技术革命 21世纪，改造生命，创造生命

2、,生物技术世纪,“我们正处在世界历史的一场伟大变革中，一场从物理学和化学时代转变到生物学时代、从工业革命转变到生物技术世纪的伟大革命”,杰里金.里夫金 美国华盛顿特区，经济趋势基金会总裁,生物技术？,生物技术（Biotechnology）根据现代生命科学理论与各种工程技术所建立的、用以改造各种生物有机体来满足人类各种需要的技术体系。以细胞与基因操作为核心。,现代生物技术产业化关键领域医药生物技术农业生物技术工业生物技术能源生物技术环境生物技术信息生物技术国防生物技术,基因工程生物技术体系的核心,转基因动、植物重组微生物,天然细胞,蛋白质、酶高分子化合物小分子化合物,工程细胞,功能基因,基因工程

3、,药物、诊断试剂基因治疗/疫苗干细胞治疗,人类自身,功能基因,动、植物、微生物,工业领域,医药领域,农业领域能源领域环境领域军事领域,基因工程是现代生物技术体系的核心 细胞工程 发酵工程 分离工程 蛋白质工程 抗体工程 酶工程 途径工程。,基因工程,基因工程（Genetic Engineering）是指按预先设计的蓝图，将不同来源的目的基因在体外与载体DNA进行拼接重组，然后导入受体细胞，并使之持续稳定繁殖，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能的技术。,二、基因工程的概念、原理与过程1、概念,广义的基因工程,基因工程 是指DNA重组技术的产业化设计与应用，

4、包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术 指的是目的基因克隆、表达载体和工程菌（或细胞）的构建与分析。下游技术 基因工程菌或细胞的大规模培养以及表达产物的分离纯化过程。,基因工程的应用,分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源,大规模生产生物活性物质,设计、构建生物的新性状甚至新物种,基因工程概念的发展,遗传工程（Genetic Engineering)DNA重组技术（DNA Recombination）分子/基因克隆（Molecular/Gene Cloning）基因工程（Gene/Genetic Engineering)基因操作（Gene Manipulation)应用领域以“基因工程

5、”、“DNA重组”为主,有关术语,克隆（clone)：无性繁殖系克隆化（cloning）：构建无性繁殖系的操作过程。重组子（recombnants)：不同来源DNA插入载体分子所形成的杂合分子。重组（recombination）：构建DNA重组子的过程构建（construct):通过基因操作获得重组DNA、重组细胞或动植物个体的过程。,工程菌（细胞）：通过基因操作所获得的、用于生产特定产物的微生物菌种（工程菌）或动植物细胞（工程细胞）。转基因动物（植物）通过基因操作所获得的、带有特定新功能基因的动物或植物。分子育种 基于基因操作技术改良动植物生产性能、并获得新品种的过程。,基因工程产业化中的几

6、个概念,基因工程的三大要素,基因：供体，目的基因（Vs用途,interesting/target gene）、外源基因（Vs宿主,foreign gene）载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗 传的DNA分子。宿主：受体，能摄取外源DNA、并能使其稳定维 持的细胞（组织、器官或个体）。,基因工程最突出的二个优点 打破了常规育种难以突破的物种之间界限 可使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。可在受体细胞内大量复制并保存目的基因 为大量制备纯化的目的基因、研究基因的结构与功能提供了基础。,2、基因工程的基本原理,基因的物质基础一致 所有物种可

7、通过DNA重组来进行遗传改造。所有物种DNA的复制机制相同 宿主来源的复制调控元件可使目的基因在异源宿主中高效扩增与稳定传代。所有物种遵循相同的基因表达原理 宿主来源的转录水平（启动子、终止子、增强子）和翻译水平（核糖体结合位点、偏爱密码子）的调控元件可实现目的基因的异源高效表达。,3、基因工程的基本过程,目的基因克隆切、接、转、增、检,获得目的基因PCR、RT-PCR、化学合成、基因文库,工程细胞或个体构建将含目的基因表达元件的载体导入特定宿主细胞或个体，并筛选可稳定遗传与表达目的基因的重组子,基因克隆的基本过程,切、接、转、增、检,mRNA,合成,大肠杆菌是中心角色,体外重组（切、接）,切

8、：用DNA限制性内切酶切割目的基因与载体DNA 接：用DNA连接酶连接目的基因与载体DNA，获得含 目的基因、复制元件与筛选标记的重组DNA分子。转：将重组DNA分子导入宿主细胞（大肠杆菌）。增：少量进入宿主细胞的重组DNA分子利用复制元件自 主复制、并大量扩增。检：利用筛选标记基因和/或目的基因的表达产物进行重 组子的筛选与鉴定。,基因工程的基本过程,基因工程（广义）基本过程,转化克隆宿主，制备表达载体。,转化表达宿主,基因工程发酵（培养）,中试规模分离纯化AKTA explorer 100,1946 1950 1955 1960 1965,1970 1975 1980 1985 1990

9、1995,1944DNA是遗传物质,1949Hbs贫血,1953双螺旋,1956HbsGlu-Val,1966遗传密码,第一个R酶,1972重组质粒,1975DNA杂交,1977DNA测序,1981转G小鼠,1983HD病G定位,1985PCR,1986位置克隆,1987G剔除小鼠,1989位置克隆,1990第一个基因治疗,1995细菌G组序列,1996酵母基因组序列,三、基因工程的历史,（一）基因工程诞生的理论基础 20世纪中期分子遗传学理论的重大进展 1确定了生物遗传的物质基础是DNA 肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验 噬菌体DNA转化实验,1944年，美国微生物学家Avery证明基因就

10、是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。,2、Watson、Crick阐明DNA双螺旋结构（1953）,3生物遗传的“中心法则”解决了遗传信息的流向和遗传性状的相互关系，揭示了生命遗传信息传递基本规律。自我复制，遗传信息由父代传给子代；通过转录，遗传信息传给RNA；通过翻译，信息传给蛋白质和酶；基因型决定生物的表型。,DNA,RNA,protein,4“操纵子”学说揭示了基因表达和调控的机制。,5、破译了全部的遗传密码,基因工程的理论依据,相同的遗传物质基础（DNA）,相同的遗传机制（DNA的复制）,相同的基因表达法则（中心法则）,通用的遗传密码（64个密码子）,多肽与基因之间存在对应关系

11、,基因可重组或转移（天然重组、转座）,1核酸内切酶和DNA连接酶的发现 为DNA的体外重组准备了基本的“工具”Smith发现了第一个限制性核酸内切酶(restrictien endonuclease，RE)HindII。分子手术刀:特异性切割Boyer发现了第一个用于基因工程的内切酶EcoRIKhorana发现了T4 DNA连接酶（Ligase），粘合剂:能将DNA片段连接在一起,（二）基因工程诞生的技术基础,Boyer发现的EcoRI,2DNA载体系统的发现 目的基因、DNA片段不能复制，也易破坏。必须连到具有复制能力的载体（vector)DNA分子上。研究表明质粒、噬菌体和病毒是理想的载体

12、分子。大肠杆菌的质粒首先用于载体。,3、大肠杆菌DNA转化体系建立 1970年发现氯化钙处理过的细胞易于吸收接纳外源DNA；1972年Cohen C报道，质粒DNA也能被大肠杆菌吸收。而后发现经过改造的质粒、噬菌体和病毒都可以携带目的DNA片段和基因，经过转化大肠杆菌，建立该基因的无性繁殖系。,4、DNA分离、纯化技术的建立 凝胶电泳：Agarose gel,PAGE 可以分离纯化DNA片段，并检测连接情况,（三）基因工程的诞生,1980年Nobel化学奖,1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：,Berg的开创性实验,将SV40的DNA片段与噬菌体的DNA片段连接

13、起来。,DNA重组(体外）：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。,（用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶）,T4DNA连接酶,Boyer 和Cohen进行了第一个基因工程实验,2、1973 年Cohen 成功地进行了体外重组和转化实验 分别把编码卡那霉素和四环素抗性基因的两种质粒酶切、连接，再将这种重组的DNA分子转化大肠杆菌，某些转化菌落具有既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗体特性。他的工作是世界上第一次成功的基因重组实验，并有基因表达及新的表型。,1973-Boyer,Cohen&Chang:真正意义上的基因工程实验Transform E.coli with recombina

14、nt plasmid,Stanley Cohen&Annie Chan,Herbert Boyer,Kanamycin resistance gene,Plasmid pSC101,Tetracycline resistance gene,E.coli transformed with recombinant plasmid,Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline,Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies,pSC

15、101,pR6-5,抗四环素,抗卡那霉素,EcoRI,抗卡那霉素基因,DNA连接酶,重组DNA分子,培养平皿,大肠杆菌,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。,Boyer-Cohen实验,1982年,2000年，法国科学家利用基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。在普遍光线下，它看上去与其它同类没有区别，但是在较暗的光

16、线下，它的身体就会放射出奇异的绿光来。,基因工程的历史性事件,1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1976：世界上第一个基因公司“Genetech”在美国成立1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFN1b上市2003:世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市,四、基因工程的未来,只 有 想 不 到 的,没 有 办 不 到 的,基因治疗,基因工程药物,疫苗（抗原）的基因工程,第二代疫苗：基因工程疫苗,第一代疫苗：灭活疫苗（牛痘疫苗）,利用酵母菌生产的

17、重组乙肝疫苗,FDA正式批准全球首支宫颈癌疫苗,生物反应器：转基因动物安全廉价环保的生物工厂,生产人血浆凝血酶原的转基因羊,第一例转基因动物转基因鼠,建立动物疾病模型,改变传统农业概念让植物生产药物,华南农大：胰岛素土豆最贵的土豆,加拿大：胰岛素香蕉,改变传统农业概念：人和植物“杂交”让植物生产人体蛋白质,抗体烟草血清白蛋白马铃薯脑啡呔油菜,生产促性腺绒毛激素的矮牵牛花,我们吃的每一口食物都曾通过遗传工程改造过。-转基因大豆:55%种植大豆(2000)-豆类食品:作为食品添加剂溜上我们的餐桌。,转基因抗农药品种,一品红,让地上长塑料！植物合成可降解塑料！,Production of speciality chemicals,EnkephalinsFatty acidsHuman serum albuminSugar monomersSugar thermoplastic polymersVaccines(e.g.hepatitis),利用微生物的废液处理厂,基因工程课程内容,5,2,3,4,1,6,7,基因工程概论,分子克隆单元操作,大肠杆菌基因工程,酵母基因工程,动物基因工程,植物基因工程,蛋白质工程、途径工程（自学）,2）如何构建？,1）如何设计？,