《基因克隆》课件.ppt

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1、现代分子生物学大实验,第一模块,基因克隆技术,凝胶回收或纯化目的基因,序列测定,质粒提取,连接产物的转化,目的基因插入载体,植物体,植物总RNA（DNA）,凝胶电泳,RT-PCR合成目的基因,基因克隆实验流程,PCR合成目的基因,实验内容,实验一 聚合酶链式反应（PCR）及 琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验二 特异扩增片段的回收纯化、连接、转化及质粒DNA的提取,实验一聚合酶链式反应技术（PCR）Polymerase Chain Reaction琼脂糖凝胶电泳检测DNA,实验目的,学习和掌握PCR扩增的原理和操作方法了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要

2、性对含有目的基因的质粒进行PCR验证。琼脂糖凝胶分离DNA的原理琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术,多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术，是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝。PCR技术实际上是在模板DNA(template)，引物(primer)和种脱氧核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶(Taq)的酶促合反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延

3、伸（extension）,PCR 简介,PCR 的应用,PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等；遗传病的产前诊断；致病病原体的检测；癌基因的检测和诊断；DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；动、植物检疫；在转基因动植物中检查植入基因的存在。,实验原理,在高温（93-95）下，DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（3765）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3端为合成的

4、起点，以单核苷酸（dNTP)为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。每一双链的DNA模板，经过一次变性（解链）、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106107倍。,实验仪器及试剂,PCR仪、掌型离心机、微量移液器、冰盒、Tip头、离心管模板,Primer,10XPCR buffer,dNTP Mixture,Taq 酶,H2O,操作步骤,

5、取PCR管，标明管号按体积配置PCR反应体系（冰上操作)轻弹管壁，混匀，掌型离心机甩至管底，立即反应,反应体系,PCR反应程序,94 3min 94 30sec 59 30sec 72 30sec 72 7min 10,30 cycles,引 物,扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，因此，引物设计也就更为重要。,长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为2024个核苷酸。有时可在5端

6、添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5端加上额外的34个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”（Primer dimer）。引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。(G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。,引物的设计,一般在0.11M之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济

7、、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。,引物在PCR反应中的浓度,引物退火,一般可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低3-5，可按公式进行粗略计算：Ta=Tm-3=3(G+C)+2(A+T)-3/5 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典型的引物浓度时（如0.2mol/L）,退火反应数秒即可完成。决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物

8、与模板错配，非特异性产物增加。退火时间一般为2040秒，时间过短会导致复性不充分，后面延伸步骤时温度升高，会导致引物从模板脱落，PCR反应失败。,引物延伸,延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度，一般为7075。在72时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。所以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的时间。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在17min。,模板,种类：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。用质粒作模板

9、时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。用量：虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的DNA。,模板变性温度,决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取9095。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之，在高温时间应尽量缩短，以保

10、持DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95。,Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。Polymerase具有5-3DNA聚合活性和5-3外切核酸酶活性，无3-5外切酶活性。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。延伸速度1-2kb/分钟，产物3端带A，可直接用于T/A载体克隆。1单位(U)Taq DNA Polymerase活力定义为在74、30分钟内，以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，将10nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。,寡核苷酸（dN

11、TP）,在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性PCR常用的dNTP浓度为50200M，不能低于1015M。使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。,用于PCR的标准缓冲液为1050mM的Tris HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl2。在72时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优

12、于Mn2+，而Ca2+无任何作用。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为110mmol/L。,PCR缓冲液,循环参数（反应温度与时间）,变性：对于富含G、C的模板应适当提高变性温度。退火：提高退火温度可减少引物与模板之间的非特异结合，提高PCR反应的特异性；降低退火温度则可提高扩增产量。如果待扩增目的DNA片段含量很少，可在PCR前几次循环中适当延长退火时间，这样有利于引物与模板的结合，提高PCR反应的灵敏度。,反应条件的调整,延伸,延伸时间由扩增片段的长度决定，扩增小于500bp的DNA片段的延伸

13、时间为20秒，扩增500l200bp的DNA片段的延伸时间为40秒扩增片段大于1kb，则需增加延伸时间。当扩增片段小于150bp时，则可省略延伸步骤，因为退火温度下，Taq DNA聚合酶的活性已足以完成短序列的合成。,反应条件的调整,循环次数：,PCR的循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般为2535次，此时PCR产物的积累即可达最大值，刚刚进入“平台期”。即使再增加循环数，PCR产物量也不会再有明显的增加。随着循环次数的增加，一方面由于产物浓度过高，以致自身相结合而不与引物结合，或产物链缠结在一起，导致扩增效率的降低；另一方面，随着循环次数的增加，Taq DNA聚合酶活性下降，引物及dNT

14、P浓度下降，易发生错误掺入，非特异性产物增加。因此，在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次数。,反应条件的调整,问题：,9700PCR仪的有哪些功能？PCR最关键的是什么？,PCR产物分析,取3l PCR产物+1 l 溴芬兰，采用0.8琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。剩余17 l PCR产物，每三个同学的PCR产物合并为一个管中 5 l 溴芬兰，进行胶回收。200ml1.6g琼脂糖,实验原理,DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动的电荷效应和分子筛效应DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，D

15、NA分子的迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型。DNA的检测是通过溴乙锭的作用溴乙锭（EB）是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，它与DNA的结合几乎没有碱基序列的特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插于一个溴乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团（菲啶环）与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用，这个基团固定位置及其与碱基的密切接近导致与DNA结合的染料呈现荧光。DNA吸收254nm处的紫外线并传递给染料，而被结合的EB本身吸收302nm和366nm的光辐射，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新被激发发出荧光，从而得到检测。,关于G

16、elRed,GelRed 是一种具有凝胶染色特性，并被设计为替换高毒性染色剂溴化乙锭（EB）的红色荧光核酸染色剂。因为GelRed 与EB有着相同的光谱特性（如图1），所以可以在不改变任何成像系统的情况下用GelRed 替换EB。如果您目前使用的是SYBR(如SYBR Green 1/SYBR Gold)染色剂，并使用紫外投射器(UV transilluminator）来观察凝胶，那么您可以使用GelRed 替换SYBR染色剂，不需要更换现有的SYBR虑光片。然而，在488 nm 激光或类似可见光下 GelRed 不能被充分地激发，如果需要，我们建议您使用我们的GelGreen(Cat#410

17、04)染色剂，其灵敏度与SYBR Green 1 一样，但其稳定性和可靠性远胜于后者。GelRed 既可用于前染(precast gel staining)，也可用于后染(post gel staining)。通常后染比前染能够获得更灵敏的特性，并能排除染色剂在电泳过程中对核酸条带分离造成任何影响的可能性。然而，前染较后染更为简单、经济，因为前染不需要额外的着色过程，并且燃料用量更少。因此，假如灵敏度和条带清晰度不成问题，前染则是首选。我们强烈建议您尝试两种染色方法，以便根据您的需要选择最佳的染色方法。,实验设备及试剂,移液器，tip头，tip头盒水平凝胶电泳槽稳压电泳仪微波炉三角瓶,琼脂糖电

18、泳缓冲液1TAEEB替代物 上样缓冲液(loading buffer),电泳缓冲液,增加样品的密度保证样品沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；能明确显现样品在电泳胶上泳动位置。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯氰迁移速率的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。,上样缓冲液,上样缓冲液(loading buffer)配方,实验步骤,用透明胶带将胶板的两端封好。配制0.8%的琼脂糖凝胶（0.16g琼脂糖于50ml三角瓶中，加入1TAE buffer 20ml），在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至60左右，加入2ul溴化乙锭充分混匀。放置合适大小的梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中

19、，凝胶厚度在3-5 mm之间，大约需要凝固20min。,实验步骤,凝胶完全凝固后，撕去透明胶，轻轻地拔去梳子，将胶槽移至电泳槽中，加入1TAE且使缓冲液没过胶面约1 mm。DNA样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加入上样孔中。盖上电泳槽，以60V电压进行电泳。当溴酚蓝前沿在凝胶中移出适当距离后（约30min），切断电流，取出胶板，在紫外灯下检测DNA泳动情况。,PCR结果,作业,其它PCR种类实验报告一PCR结果的分析,试验结果,第一组,第二组,第四组,第三组,试验结果,第一组,第二组,第三组,第四组,特异扩增片段的回收纯化 目的片段与载体的连接,实验目的,了解“DNA片段快速胶回收

20、试剂盒”回收纯化DNA片段的原理；了解利用pGEM-T载体与PCR产物连接的原理；掌握特异扩增片段的回收纯化以及与载体连接的方法。,实验原理,回收纯化DNA利用在盐试剂存在的情况下，核酸能吸附在硅基质膜上的特性，用于对DNA片段进行纯化。目的片段与载体的连接利用PCR产物带有粘性末端A，以及载体上带有T粘性末端，在T4连接酶的作用下，在一定的温度条件下发生连接的原理达到使得目的片断与载体连接的目的。,实验仪器及试剂,仪器：恒温水浴，水平电泳槽、电泳仪、迷你离心机用品：离心管、移液器、500ml三角瓶等。试剂：连接试剂盒、纯化试剂盒；1TAE电泳缓冲液、GelRed、凝胶上样缓冲液、琼脂糖,凝胶

21、电泳回收DNA？,连接反应、杂交反应、标记反应、扩增反应等去除非特异带脱盐，去除dNTPs去除引物去除酶（碱性磷酸酶等）如果电泳是唯一的特异带，可以从PCR产物的DNA溶液中直接纯化回收,实验步骤,PCR产物电泳PCR产物回收纯化纯化产物与载体连接,琼脂糖凝胶回收DNA,凝胶获得及处理 在UV照射下准确切取目标条带，放入1.5ml 管中 加入3倍体积的DD溶胶液，（如果凝胶重为100mg，加入300ulDD）放入56度金属浴10min。每23min振荡一次加速溶解。将得到的溶液加入吸附柱AC中，室温放置1min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。加入700ul漂洗液WB，120

22、00rpm离心30sec，倒掉收集管中的液体。将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50ul洗脱缓冲液EB，室温放置2min12000rpm离心1min。得到纯化后DNA片段。,纯化产物与载体连接,在0.2ml的PCR管中，依次加入 纯化PCR产物 7.5ul buffer 1ul pBS-T载体 1ul T4 DNA连接酶 0.5ul 混匀，离心，去除气泡。16度恒温水浴连接1216h。,试验结果,思考问题：,连接的原理是什么呢？载体与目的片断的关系？,质粒DNA的

23、转化,实验目的,了解外源基因转入细胞的原理掌握热激转化的方法掌握蓝白斑筛选的基本原理,实验原理转化,转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。当细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。,实验原理蓝白斑筛选,互补：E.coli-半乳糖苷酶的两个无活性的片段组合而成

24、为功能完整的酶的过程。pGEM-T载体上的poly-T位点位于可产生肽段的lac-Z基因位点之内。若有外源基因插入此则破坏编码读框产生没有活性的肽段。宿主菌为缺失产生肽段的突变体，但能产生酶的其它肽段（肽段）。,载体与宿主菌两者之间进行基因内互补就产生有活性的-半乳糖苷酶。在IPTG的诱导下，载体产生的肽段与宿主菌产生的肽段结合成有活性的-半乳糖苷酶，此酶能使显色底物X-gal分解成不溶于水的蓝色化合物，从而使菌落变蓝。若有外源片段插入此位点，则使载体的-半乳糖苷酶基因失活，不能产生肽，也就不能形成有活性的-半乳糖苷全酶，X-gal不能被分解，菌落为白色。,实验仪器及试剂,试剂含有目的基因的连

25、接产物即含有DHY 基因的质粒载体TOP10感受态的大肠杆菌LB培养基（液体与固体）抗生素（AMP）及X-gal,IPTG 仪器超净工作台、摇床、植物培养箱、高速冷冻离心机用品培养皿、三角瓶、1.5ml离心管、移液器、冰盒,所需试剂,LB培养基（50 g/ml Amp）：提供细菌生长所需营养，并进行抗性筛选。用5M NaOH 4850l调pH值至7.0。Amp干扰肽聚糖交联而抑制细胞壁的合成Mr=394.4（50mg/ml)：溶于水，用0.22m滤膜过滤灭菌，于不透光的容器内贮藏于-20。,LB培养基配方,操作步骤,配制LB固体培养基，高温灭菌后冷却至60度左右时加入相应抗生素（氨苄青霉素）混

26、匀后倒平板。取感受态细胞置于冰上，加入3ul连接后的质粒载体，冰上混匀，放置10分钟。42度水浴热激45s后迅速置于冰上2分钟，加入预热的LB液体培养基800ul37度培养30分钟，160rpm平板表面涂50ul 等体积的 X-gal/IPTG.20 min后涂适量的菌液，标明板号，37度倒置过夜培养。7.次日长出蓝白斑后4度保存。,质粒DNA的提取,实验目的,了解碱裂解法制备质粒的原理掌握质粒DNA小量制备的方法,什么是质粒？,质粒是细胞染色体外能够独立稳定遗传的共价闭合双链环状DNA分子，约为1200kb，每一个质粒都带有一段DNA复制起始序列，使其能在宿主细菌中复制。质粒存在与否一般对细

27、菌的生存没有决定性的影响。而质粒本身所带的基因通常有利于宿主细胞，能够提供给宿主细胞一些表型，如抗药性、分解复杂有机物的能力等。,质粒的构型,共价闭合环形DNA(cccDNA)：其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，这样的DNA通常呈现超螺旋的sc构型；线性分子(lDNA)：质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性DNA分子，通称L构型。开环DNA(ocDNA)：两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口，此即OC构型；,实验原理,碱裂解法是利用宿主菌线性染色体DNA与共价闭合环状质粒DNA在拓扑学上的结构状态差异来分离提取质粒DNA。

28、在碱性(pH12.012.5)条件下，破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性充分，质粒DNA的氢键虽也被破坏，但由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时(加入酸性试剂中和)，共价闭合环状质粒DNA链会迅速准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子；而线状的细菌染色体DNA分子由于两条互补链彼此已完全分开，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，通过离心去除。而质粒DNA则留在上清液中，通过异丙醇沉淀及70%乙醇洗涤后即可得到质粒DNA。,实验试剂,LB液体培养基（+Amp）重组单克隆的细胞培养物溶液、溶液、溶液RNase氯仿/异戊醇（24:1）异丙醇70%乙醇双蒸水,

29、试剂配制,LB液体培养基*溶液*(P1)50mM葡萄糖,20mM TrisHCl(pH=8.0),10mM EDTA（pH=8.0）溶液(P2)0.2 mol/L的 NaOH,1%（m/V）SDS（无需灭菌，现用现配）溶液*(P3)乙酸钾溶液pH4.85.2，100 ml溶液中含 5 mol/L 乙酸钾 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。氯仿/异戊醇（24:1）注：*表示需1.05kg/cm2压力下蒸汽灭菌20min,试剂作用,溶液：悬浮细菌，改变细胞膜的通透性。溶液：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒DNA和染色体DNA，在高pH（12.012.5）条件下

30、，破坏碱基配对，使DNA变性。溶液：使DNA分子复性，线状染色体DNA聚集成不可溶的网络状聚合物，而质粒DNA得以完全复性。同时高浓度的醋酸钾会引起蛋白质-SDS复合物和高分子质量的RNA分子发生沉淀。氯仿/异戊醇：蛋白质变性剂，氯仿有强烈的溶脂倾向。RNase（10mg/ml）：将大分子RNA降解成以3嘧啶核苷酸结尾的最终产物，小分子RNA可以通过沉淀和离心处理去除。,实验仪器,摇床移液器，tips 振荡器离心机培养箱或金属浴电泳仪凝胶成像仪,实验程序,细菌的生长与收获 质粒DNA的获得 琼脂糖凝胶电泳鉴定,细菌的生长与收获,接菌各组取装有25ml LB液体培养基和25l氨苄青霉素（50 m

31、g/ml）250 ml三角瓶中，用灭菌牙签或接种环挑取一白色单克隆，放入三角瓶内，37过夜培养到OD600=1.4。菌液保存菌液取500 l于1.5 ml离心管中，同时加入40%甘油500l即甘油与菌液的比例为1:1，液氮冷却，在-80 保存菌种。,质粒DNA的获得1,菌液的收集：取1.0ml的菌液放入1.5ml的离心管中，离心9000rpm，30sec，尽可能的倒干上清，收集菌体(重复一次）。用250ul溶液1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。加250ul溶液2，温和地上下翻转6-8次使菌体重复裂解。加350ul溶液3，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。12000rp

32、m离心10min，小心取上清。向吸附柱中加入500ul平衡溶液，12000rpm离心1min。将上一步所得上清加入加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30-60sec倒掉收集管中的废液。,质粒DNA的获得2,加入700ul漂洗液W2，12000rpm离心30sec，弃掉废液。加入500ul漂洗液W2，12000rpm离心30sec，弃掉废液。将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30UL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1

33、min。电泳检测，取5ul1ul上样缓冲液,讨论,细胞的裂解作用是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。通常是加入溶菌酶或SDS来促使大肠杆菌细胞裂解的。如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒DNA的回收率。理想的状况是使每一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体分子。提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作中手法要温和，尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA的降解和破坏。,500bp 目的片段,聚合酶链式反应技术（PCR）,A.上图PCR产物电泳结果存在什么问题，如何解决？,琼脂糖凝胶纯化和PCR产物纯化分别适用于什么情况？为什么要进行特异扩增片段的回收纯化？,特异扩增片段的回收纯化,转化后进行蓝白斑筛选的原理是什么？,目的片段与载体的连接及质粒DNA的转化,分析以上质粒电泳图解释以下现象：质粒提取的三条带分别代表什么结构的质粒？上样孔中的较亮条带是什么？分析其出现原因及解决方法图中最下行较亮条带是什么？分析其出现原因及解决方法,质粒DNA的提取,END,