《培养基及制备》课件.ppt

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1、第二章,培养基及其制备,培养基组成,培养基：指一切可供微生物细胞生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。,培养基的作用：,满足菌体的生长 促进产物的形成,一、基本营养源 1、碳源 凡可提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源及合成菌体和产物所必需的碳骨架成分的营养物质。常用的碳源有：糖类、油脂、有机酸和低碳醇等,工业上常用的糖类,葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应,糖蜜,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。糖蜜分甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。,淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶

2、类,缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶，成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。,优点：来源广泛、价格低难利用，可以解除葡萄糖效应,工业上常用的糖类,油脂类：能利用这类碳源的M一般都有比较活跃的脂肪酶。M利用这类碳源时所消耗的溶解氧会增加，当供氧不足时，会引起pH下降。常用的油脂类有：各种动、植物油，豆油、菜籽油、棉籽油、鱼油、猪油等。,有机酸有机酸的利用常会引起发酵体系pH上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随有碱性物质的产生，使pH进一步上升。常用的有机酸有：乳酸、醋酸、柠檬酸等。,烃和低碳醇类正烷烃已经用于有机酸、氨基酸、抗生素、维生素和酶制剂发酵中，甘油也常用作抗生

3、素生产和甾体转化的碳源。,、氮源：凡可构成细胞和代谢产物中氮素来源的物质。常用的氮源分两大类：有机氮源和无机氮源。（）无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓速效氮源。但无机氮源的迅速利用会引起pH的变化(NH4)2SO4 2NH3+2H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH,（）有机氮源 来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟 有机氮源成分复杂，除提供丰富的Pr.、aa.外，还含糖类、脂肪、无机盐及生长因子。由于有机氮源营养丰富，M在含

4、有机氮源的培养基中表现出生长旺盛、菌丝浓度迅速增加等特点。,3.无机盐,构成菌体的成分，作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节渗透压、pH值和氧化还原电位等,例A：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理,4.微量元素,5.生长因子,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,作用：提供微生物重要化学物质、辅助因子（辅酶和辅基）的组分和参与代谢,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微

5、生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,6.前体和产物促进剂,e.g.青霉素发酵中加玉米浆发酵单位由20U/mL提高到40U/mL。玉米浆中含有苯乙胺，它被优先结合到青霉素分子中去，从而提高产量。有些前体物质，例如苯乙酸、丙酸等浓度过高时，对菌体会产生毒性。有些菌体还有将前体氧化分解的能力。在生产中常采用少量多次地加入前体。总的加入量可按一个产物分子，进入几个前体分子，按等摩尔计算前体加入量，在总的加入量中，还应考虑菌体氧化、分解的那部分前体。,用量：前体的用量可以按分子量衡算

6、，具体使用有个转化 率的问题,例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素6000*0.6（微克）3.6mg/mL 苯乙酸（3.6*136）/356=1.38mg/mL=1.38%,产物 前体 产物 前体,青霉素苯乙酸及衍生物 青霉素苯氧乙酸金霉素氯化物链霉素 肌醇、精氨酸红霉素 丙酸、丙醇,VB12 钴化物葫萝卜素-紫罗兰酮L-异亮氨酸-氨基酸L-色氨酸 邻氨基苯甲酸L-丝氨酸 甘氨酸,发酵生产中常用的前体,促进剂(promoter)：既不是营养物，又不是前体，却能提高产量的添加剂。巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉素生产菌自溶推迟，延长产物的分泌期。酵母甘露聚糖可诱导-甘

7、露糖酶的产生，促使甘露糖链霉素转化为链霉素(streptomycin)。聚乙烯醇衍生物可防止菌丝结球，提高糖化酶(saccharifying enzyme)的产量。表面活性剂(surface active agent)：在底物和产物均不溶或微溶于水的发酵中，表面活性剂有增加渗透性(perviousness)、促使固体物分散从而强化传质和传氧的作用。,抑制剂（inhibitor）：在发酵过程中能产生抑制作用的物质,在发酵过程中加入某些抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一个代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一中间物积累起来。,抑制剂（inhibitor）：,1、按状态

8、,固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产,半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8%,主要用于微生物的鉴定。,液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。,二、培养基的类型与用途,2、按来源（纯度）,合成培养基:原料其化学成分明确、稳定,适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律,培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产,天然培养基:采用天然原料,原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性

9、,二、培养基的类型与用途,半合成培养基：天然成分+纯化学试剂,3、按培养基的用途划分,二、培养基的类型与用途,基础培养基：一般微生物生长的基本营养物质增殖培养基：适合某种微生物生长而抑制其他达到分离鉴别培养基：能否利用某种成分并借助指示剂以鉴别选择培养基：加入某种化学物质粗筛目的菌而抑制他菌,TEXT,TEXT,TEXT,TEXT,四、菌种鉴定结果,图2菌落形态,图3 营养细胞,图4 出芽细胞,图 5 子囊孢子形态,1.形态鉴定,4、按目的（从发酵生产应用考虑）孢子（斜面）培养基 种子培养基 发酵培养基,二、培养基的类型与用途,孢子培养基,要求：促进菌体迅速生长，产生较多优质孢子且不会引起菌种

10、变异。特点C、N源不宜多，否则只长菌丝，少长或不长孢子；无机盐浓度要适当控制，否则会影响孢子的颜色和孢子量。,种子培养基,目的 扩大培养增加细胞数量；培养高活力细胞；加速细胞分裂或菌丝生长要求营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些；培养基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子发芽生长，保证球形；pH要稳定；最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少量发酵合成期才大量需要的物质。,发酵培养基,目的：使接种菌丝生长并能高效表达，获得高的发酵产量，同时组分尽可能单一，以保证高的得率。要求营养丰富完全，有利于产物合成；不能大量加入快C、快N源，应和慢C、N源相结合；在产物分泌期间，pH 稳定；加入适量

11、合成所需的物质，如前体等，进行定向发酵；采用中间补料，以提高发酵单位；原料的考虑成本问题,能够满足生产菌生长、代谢需要目的代谢产物的产量最高利于提高培养基和产物的浓度以提高生产能力利于提高产物合成的速度，缩短发酵周期减少副产物的形成便于分离纯化原料低廉，质量稳定，取材容易原料减少对通气搅拌的影响，提高氧利用率，降能耗来源广泛且供应充足利于产品分离纯化，减少产生三废物质废物的综合利用能力强且容易处理,三、工业培养基选择,提供必要的营养成分配制合适的浓度主成分和其他成分的配比控制合适的pH添加有关前体物质和诱导物阻遏物或抑制剂的影响金属离子的影响,四、培养基的配制原则,、培养基成分的选择原则,1.

12、菌种的同化能力2.代谢的阻遏和诱导作用3.合适的碳氮比4.pH的要求,当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。,、培养基设计的步骤,根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑 的问题，初步确定可能的培养基成分；,通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；,、实验设计,培养基成分的含量最终都是通过实验获得的,合理的实验方法,均匀设计、正交实验设计、响应面分析,多因子实验,原培养基:,初步确定可能的培养基成分(以碳源为例),通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例),考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源,进一

13、步：通过单因素试验确定乙酸钠的浓度0.2%比较好,结果：,碳源：乙酸钠 0.2%,氮源：氯化铵 0.2%酵母膏0.03%,无机盐:复合无机盐0.05%,正交设计确定优化的配方,改进后培养基,原培养基,改进后培养基的发酵结果,表3-1 PlackettBurman设计筛选影响Y-21生长的关键培养基组分,表3-2 PlackettBurman设计12次试验确定9种变量的影响,用SAS软件分析试验结果,用SAS软件分析试验结果,当P值小于0.05时，为影响显著因素，通过表可以看出X1蔗糖，X2蛋白胨，X3酵母膏，X8磷酸二氢钾，X9硫酸镁 的值均小于0.05，其数据的R2检验为99.65%，表明可

14、信度为99.65%。,第五节 淀粉的制备葡萄糖工艺,一、淀粉的组成及特性1、淀粉的组成(C6H10O5)n聚合度 直链淀粉和支链淀粉淀粉颗粒的构成如下图：氢键 聚集 淀粉分子链 针状晶体 淀粉颗粒,2、淀粉的特性淀粉的膨胀和溶解膨胀：淀粉是一种亲水胶体，遇水加热后，水分子渗入淀粉颗粒的内部，使淀粉分子的体积和重量增加，这种现象称为膨胀。糊化：在温水中，当淀粉颗粒无限膨胀形成均一的粘稠液体的现象，称为淀粉的糊化。此时的温度称为糊化温度。,溶解或液化：淀粉糊化后，如果提高温度至 130，由于支链淀粉的全部（几乎）溶解，网状结构彻底破坏，淀粉溶液的粘度迅速下降，变为流动性较好的醪液，这种现象称为淀粉

15、的溶解或液化。,淀粉糊化、液化过程中醪液粘度的变化,温度,粘度,a,t1,t2,1,2,b,c,二、淀粉制备葡萄糖的方法和原理,工业上，将淀粉水解成葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。,、淀粉的糖化,1，糖化理论糖化：以无机酸或酶为催化剂，在一定温度下使淀粉水解，将淀粉全部或部分转化为葡萄糖等可发酵性糖的过程。糖化剂：糖化过程中所用的催化剂。包括无机酸和酶。糖化的目的：将淀粉转化为可发酵性糖。,、淀粉的糖化,2，淀粉糖化的方法酸解法酶解法酸酶结合法,（1）酸解法（酸糖化法）定义：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。淀粉水解过程的反应主反应：糖化（水解作用）副反应：复合

16、反应（在酸和热作用下，部分葡萄糖经-1，6键结合成龙胆二糖，-1，6键结合成异麦芽糖和其他低聚糖。）分解反应（葡萄糖分解为羟甲基糠醛，有机酸和有色物质等非糖产物）,淀粉的水解反应过程淀粉分子内-1，4和-1，6葡萄糖苷键的断裂，相对分子质量逐渐变小，依次变为糊精，低聚糖，麦芽糖和葡萄糖。糊精是若干种分子大于低聚糖的碳水化合物，一般含210葡萄糖单位的为低聚糖。糊精具有旋光性，还原性，能溶于水，不溶于酒精。与碘作用，聚合度不同颜色不同。,葡萄糖聚合度与碘液的呈色表,糖化的过程检测检验液化：是否有淀粉，用碘液，是否呈兰色；检验糖化：是否水解完全测定还原糖；用无水酒精。,DE值：糖化液中还原糖含量（

17、以葡萄糖计）占干物质的百分率，用以表示淀粉糖的糖组成。还原糖用斐林法或碘量法测定，干物质用阿贝折光仪测定。,理论收率（111.11%)（C6H10O5)n+nH2O nC6H12O6 162 18 180实际收率（105%108%）淀粉转化率,葡萄糖,二糖，三糖和其他低聚糖,酸和热,复合反应,异麦芽糖和龙胆二糖,降低葡萄糖的收率，发酵的残糖增加，抑制菌体生长和产物形成，增加提取和精制的难度,淀粉 羟甲基糠醛 乙酰丙酸+蚁酸+有色物质等。,其它副反应,缩短反应时间，控制反应，降低葡萄糖的浓度,减少,（1）酸解法（酸糖化法）,优点：工艺简单，设备较单一水解时间短，设备周转快缺点：需耐高温、高压和耐

18、腐蚀的设备副产物多，淀粉的转化率低对原料要求高淀粉乳浓度不宜太高，太高转化率下降废水难处理,（2）酶解法定义：以酶为催化剂，在常温常压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。包括液化和糖化两个过程，故又称双酶水解法。,淀粉,a-淀粉酶,葡萄糖，麦芽糖和麦芽三糖。异麦芽糖和低聚糖。,（一）液化,（1）淀粉水解涉及的酶-淀粉酶：其作用是将淀粉迅速水解为糊精及少量麦芽糖，对淀粉的作用，可将长链从内部分裂成若干短链的糊精，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到-淀粉酶的作用后，遇碘呈色很快反应，如下表现：蓝紫红浅红不显色(即碘原色)糖化酶：作用于淀粉的-1，4键结合，能从葡萄糖键的非还原性末端起将葡萄糖单位一个一个的切断，

19、因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。,-淀粉酶：-淀粉酶是内切型淀粉酶，能水解-1，4糖苷键，使直链淀粉水解成麦芽糖、麦芽三糖和较大分子的寡糖，然后缓慢水解成麦芽糖和葡萄糖不能水解-1，6糖苷键，但能越过-1，6糖苷键继续水解-1，4糖苷键。所以液化液除了麦芽糖和葡萄糖外还有一系列带-1，6糖苷键的寡糖,糖化酶的水解作用糖化是利用糖化酶将淀粉液化产物糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程。糖化过程葡萄糖含量不断增加。糖化酶对底物的作用是从非还原性末端开始的。产生a-葡萄糖。糖化酶对a-1,4和a-1,6 糖苷键都能水解。,（二）糖化,2）酶解法,优点：反应条件温和副反

20、应少，淀粉质量高可在较高淀粉浓度下水解，对预料要求不高糖液的质量高、营养物质较丰富缺点：水解时间长，夏天糖液容易变质设备较多,3，糖化方法的比较水解时间：酸法短，酶法长水解程度：酶法高糖液杂质：酶法低，酸法高综合,（3）酸酶结合解法定义：集中酸解法及酶解法制糖的优点而采用的生产方法。包括酸酶法和酶酸法两种。酸酶法：酸水解淀粉至DE值10%-15%，降温、中和加糖化酶进行糖化酸液化速度快糖化酶可在较高淀粉浓度下水解，提高生产效率用酸量少，糖液质量高、产品色泽浅酶酸法：主要是先用a-淀粉酶将淀粉液化到一定程度，过滤除杂，然后用酸水解成葡萄糖淀粉颗粒不均的淀粉，酸水解常导致水解不均匀第二步酸水解时，pH值可稍高，减少副反应，糖色泽较浅,