《人工授精技术》课件.ppt

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1、第五章 人工授精技术（Artificial Insemination，AI）,计划学时数：45h教学目的与要求：1.了解人工授精的意义、发展概况；2.掌握采精要求、技术，精液品质的检查、稀释、保存；3.掌握精液冷冻保存原理、技术程序；4.掌握输精前的准备、输精要求和技术。,主要内容 第一节 概述(意义、基本要求、发展史）第二节 采精 第三节 精液的处理 第四节 输精,第一节 家畜人工授精概述,一、人工授精的概念及其在繁殖生产中 的意义二、家畜人工授精技术的发展概况,第一节 家畜人工授精概述,一、家畜人工授精的概念及其在繁殖生产中的意义人工授精的概念：是利用器械采集公畜的精液，经过精液品质检查和

2、稀释等处理后，再用器械将精液输入到需要配种的发情母畜的生殖道内，以代替公、母畜自然交配而繁殖后代的一种繁殖技术。人工授精的主要技术环节：采精、精液品质检查、精液的稀释、精液的分装、精液的保存（液态保存、冷冻保存）、精液的运输、精液的解冻与检查、输精,第一节 家畜人工授精概述,家畜人工授精的意义（优越性）可提高优秀种公畜的配种效能和种用价值扩大配种母畜头数。牛：自然交配1：401：100头/年，AI1：60001：12000/年。上世纪80s中期，美国有一头无角海福特公牛全年生产的冷冻精液达23.8万头份；另有一头特别优秀的种公牛，年生产冷冻精液达35万头份。,第一节 家畜人工授精概述,可大幅度

3、地减少种公畜饲养头数，节约饲养成本。,第一节 家畜人工授精概述,可加速家畜品种改良，有利于提高畜群质量。美国 牛19261946年 靠增加乳牛头数，全国产奶量年均递增11.6（1946年年均产奶量为1900kg/头）；19461966年 利用人工授精技术大规模地推广优良品种，在奶牛饲养头数略有减少的情况下，年均产奶量提高了65（平均产奶量达3826kg/头）；19661986年 广泛采用冷冻精液配种，平均每头母牛产奶5846kg，比二十年前又提高了52.8%。随着人工授精技术的推广应用，美国还涌现出了一些优秀的高产个体母牛，1974年有一头黑白花牛年产奶达23405kg，80年代更有一头牛年产

4、奶25270kg。,第一节 家畜人工授精概述,可防止接触性感染疾病的传播，布氏杆菌病以及某些寄生虫病的传播均可得以杜绝。有利于提高母畜的受胎率可实现“无障碍配种”，提高繁殖效率。能够克服公母畜因个体大小的差异过大所造成的交配困难；对患有阴道炎的母畜或子宫颈口不正的母畜，也可以使之正常受胎；可有效地避免自然交配的盲目性（能对精液的质量进行监测，杜绝无精症或少精症公畜造成的损失）。,第一节 家畜人工授精概述,有利于种质交流和扩大配种地域：借助于精液保存技术，能扩大精液利用的时间和空间范围。精液可远距离运输，实现无公畜的异地配种（无种畜人工授精站）。简化检疫手续，降低运输成本，有利于国际或地区间的家

5、畜种质交流。我省正阳种猪场自1998年开始开展AI，通过空运精液，与外省进行协作育种。,第一节 家畜人工授精概述,做好家畜人工授精必须具备的基本条件有技术熟练和责任心强的技术人员。精液要采自合格的种公畜，且精液品质优良。严格执行操作规程，特别要确保精液和母畜的生殖道在操作过程中不被细菌或其它有害理化因素的污染（无菌操作是最重要的）。要有一定的必需设施和设备，以满足采精或精液保存、精液品质检查和对母畜进行发情鉴定与输精的需要。,第一节 家畜人工授精概述,二、人工授精技术的发展概况家畜人工授精的发展历史 大体可分为三个阶段：试验性研究阶段：自18世纪80年代初开始至20世纪30年代，历时近150年

6、。人类于1677年第一次发现精子（Leeu Wenhoek），100年后（1780年）世界上第一例人工授精试验在犬获得成功（Spallanzani，意大利）。19世纪末伊万诺夫 马的AI（苏式假阴道的由来）。20世纪30年代初，人们创造性地把假阴道的使用和精液的处理结合起来，初步形成了一套较完整的人工授精技术。,第一节 家畜人工授精概述,生产性实用阶段：从20世纪40年代到60年代。欧洲、北美和日本等应用得最早（主要是乳牛）。大规模的高度集约化现代畜牧业的出现，更促进了它在世界范围内的进一步地推广应用。,第一节 家畜人工授精概述,冷冻精液阶段 始自1950s。精液冷冻技术开发成功时间：1951

7、年，英国学者Polge（波吉）、澳大利亚人Smith等分别用含甘油的稀释液用干冰（-79）保存鸡的精液获得成功；英国学者Stewart于1951年成功地用牛冻精获得第一头犊牛。冷源：1950s，北美国家率先利用液氮(LN2，-196)作冷源（当时其他国家用干冰），冻精效果显著提高。从60年代起，牛的冷冻精液开始在人工授精中广泛应用，世界各国也普遍采用液氮作为保存冻精的冷源。,第一节 家畜人工授精概述,冻精技术的利用现状：迄今为止，在全世界，只有牛的冷冻精液是最成功的（到1978年底，南非等21个国家和我国的台湾地区，牛的冻精配种普及率已达100）；其次是山羊的冻精（但我国尚未解决山羊冷配受胎率

8、低的问题冻精稀释液不合适），其他动物的精液冷冻保存技术，都仍在继续研究中。在猪的冻精研究方面，我国广西（自治区畜牧研究所）处于领先地位。,第一节 家畜人工授精概述,第一节 家畜人工授精概述,我国家畜人工授精的发展概况 我国开展家畜人工授精的时间虽然比欧美等畜牧业先进国家要晚，但在发展速度、普及范围以及涉及的畜禽种类等方面取得的成就异常巨大。40年代末：首先在新疆、内蒙、广西等地开展牛和绵羊的人工授精。新疆细毛羊的成功培育得力于人工授精技术的应用。50年代：在猪和马上进行试验。,第一节 家畜人工授精概述,1958年我国家畜人工授精的总数便居世界第二位，马匹的人工授精数量更是居世界首位。在国内人工

9、授精最早得到普及的是奶牛，目前已经达到90%以上，本地黄牛的杂交改良在河南、河北、山东、安徽、东三省、内蒙和新疆等省开展的比较好。水牛的AI在云南开展的比较好。另外还包括广西福建和贵州也有一定基础。猪的AI主要在南方各省开展的比较好，如广西、湖南、福建、江苏、浙江、四川等省。,第一节 家畜人工授精概述,我国推广畜禽人工授精的形式：70s，许多省（区）大多以县为单位建立起了人工授精网络，几乎各乡镇都建有人工授精站或无种畜人工授精点。改革开放以来，牛的配种大多采用冷配（在农村，主要由个体配种户承担）；集约化饲养的羊、猪的配种正在普及人工授精，种鸡场已全部采用了AI。,第二节 采精,一、概念：用人工

10、方法把公畜的精液采出体外并收集起来的技术操作叫采精。二、采精前的准备采精场地和台畜采精器材采精人员种公畜,第二节 采精,采精场地与台畜采精场地 要有一个适宜的采精环境（室外或室内），以有利于公畜建立和保持射精的条件反射。采精场地的基本要求：场所固定、宽敞、地面平坦而不滑、安静、清洁，有必要的采精设施如采精架供拴系或保定活台畜的采精架（马、驴用采精横架；牛用两侧带有倾斜踏板的采精架）或假台畜（马、驴、猪、羊用）。室内采精场面面积为10*10平方米，并附设喷洒消毒和紫外线照射杀菌设备。,第二节 采精,2.台畜的准备 台畜：是采精时供种公畜爬跨的同种活畜或人工支撑物。真台畜应具备的条件：体格大小适中

11、，体质健壮，性情温顺，健康无病，一般用发情良好的同种母畜充当（马、驴可互换），牛也可用经过训练的公牛来充当。假台畜：是模仿母畜体型高低大小，选用金属材料或木料做成的一个供采精时种公畜（猪、羊、马属动物）爬跨的人工支撑物。,第二节 采精,第二节 采精,假台畜的制作要求：假台羊要求尽量逼真；猪的不要求形似；假台马略具马的轮廓即可，但均要求结实、牢固。外表通常包裹一张同种的母畜皮（马、驴）或麻袋之类的替代物（猪），使之既具一定的视觉效果，又能保证公畜的安全。,第二节 采精,第二节 采精,兔：调教好的公兔对“台兔”不很挑剔（只需在人的手臂上搭一条颜色合适的毛巾即可）。犬（犬科动物）：采精时不必用任何依

12、托物。,第二节 采精,采精器材的准备 假阴道、集精杯（瓶、管）等，连同精液处理及输精用的器具一起，事先进行灭菌处理（将直接与精液相接触的器具内壁灭菌后要用灭菌的精液稀释液冲洗2-3遍）。传统的洗涤剂是23的碳酸氢钠或l1.5的碳酸钠溶液。在基层单位常采用肥皂或洗衣粉代替，但安全性不及前者。器材用洗涤剂洗刷后，务必立即用清水多次冲洗干净而不留残迹，然后经过严格消毒方可使用。,第二节 采精,1.玻璃器材 采用电热鼓风干燥箱进行高温干燥消毒，要求温度为130150，并保持2030分钟，待温度降至60以下时，才可开箱取出使用。也可采用高压蒸气消毒，维持20分钟。2.橡胶制品 一般采用75酒精棉球擦拭消

13、毒，最好再用95的酒精绵球擦拭一次，以加速挥发去残留在橡胶上面的水分和酒精气味，然后用生理盐水冲洗。对于猪、马用的输精胶管，可放入煮沸的开水中浸煮35分钟，然后用生理盐水冲洗。,第二节 采精,3.金属器械 可用新洁尔灭等消毒溶液浸泡，然后用生理盐水等冲洗干净。也可用75的酒精棉球擦拭；或用酒精灯火焰消毒。4.溶液 如润滑剂和生理盐水等，可隔水煮沸2030分钟；或用高压蒸气消毒，消毒时为避免玻璃瓶爆裂，瓶盖要取去或插上大号注射针头，瓶口用纱布包扎。5.其他用品 如药棉、纱布、棉塞、毛巾、软木塞等，可采用隔水蒸煮消毒或高压蒸汽消毒。,第二节 采精,采精人员的准备 依畜种和采精方法的不同而异（人数及

14、分工，有的畜种需有专人管理种公畜或活台畜）牵公马的方法：2人或1人，缰绳牵短便于控制其头部，防马踏住脚）。,第二节 采精,种公畜的准备1.采精训练（调教）利用假台畜采精，必须先对种公畜进行训练使之适应。没有交配经验的公畜利用假台畜进行采精训练一般都较顺利。有交配经验的成年种公畜用假台畜进行采精训练往往需经多次调教（以发情母畜作台畜则较顺利）。,第二节 采精,（1）采精训练的方法气味诱导法在假台畜后躯部涂抹发情母畜阴道分泌物或尿液。利用刚采过精的假台畜。示范诱导法 让待调教的公畜观摩其它种公畜的采精过程（注意安全）。发情母畜诱导法 让一头发情旺盛的母畜站在假台畜的侧前方，诱导公畜爬跨假台畜（猪还

15、可用一头发情的小母猪藏在假台猪的腹下，让被调教的公猪听到和嗅到发情母猪的存在）。,第二节 采精,（2）调教注意事项A.耐心诱导 对待种公畜不能粗暴，以免造成性抑制。B.适时采精 公畜爬跨到假台畜的背上后，要及时地进行采精，使其建立起正确的条件反射。C.加强重复 调教的场地、人员要固定，在同一环境条件下反复进行调教训练（一般可隔日或每日一次）。D.注意人畜安全和避免精液污染人畜安全：提防人员被踏伤或踢伤；勿使种公畜阴茎受伤。种公畜外阴部清洗：各种动物的包皮口周围予以清洗、消毒，猪的还要挤除包皮腔内的积尿。,第二节 采精,2.种公畜的性准备 平时的准备 应合理地进行管理。具体的措施：保证种公畜的体

16、况良好、性欲旺盛。要避免其过肥、过瘦或采精过频。确属必要时可适度利用LH提高种公畜的性欲（不可频繁使用雄激素）。采精前的准备 合理加强性刺激，采用不同的方法使公畜有充分的性兴奋和性欲，一般采用让公畜在台畜附近停留片刻，进行几次假爬跨。,第二节 采精,（五）采精的方法理想的采精方法应具备的条件 充分 可保证公畜充分射精，在某些畜种要求能收集一次射出的全份精液；优质 精液品质不发生改变（不污染）；安全 不损害公畜的生殖器官和性机能；简便 器械简单，方法实用，应用方便。,第二节 采精,常用的采精方法家畜的采精方法：假阴道法 适用于各种家畜（犬除外）。手握法 适用于猪。按摩法 适用于禽类、犬科动物（对

17、不能站立的牛也可用）电刺激采精法 适用于野生兽类的采精方法，（常需用氯胺酮等镇静剂保定，但采出的精液往往射精量大而精子密度很低；对某些动物如家兔只能引起阴茎强直性勃起而不射精）。,第二节 采精,（1）假阴道法假阴道的构造：其原理是模拟母畜阴道环境条件的人工阴道，诱导公畜射精而采集精液的方法。假阴道是一筒状结构，主要由外壳、内胎、集精杯及附件构成。,第二节 采精,假阴道的准备 采集到符合要求的精液，假阴道应具备的条件：适当温度：假阴道内胎温度一般控制在3840，通过注入相当于假阴道内外壳容积2/3的温水来保持。集精杯温度也应保持在3435。适当压力：借助于水和空气来调节假阴道的压力。Y字型适当润

18、滑度：用消毒的润滑剂对假阴道内表面加以润滑，涂抹部位一般是假阴道全长的1/22/3。,另外保持接触精液的部位消毒无菌，无破损漏洞。,第二节 采精,假阴道采精操作要点采精人员的站立（或蹲）的位置：站立于台畜的右后侧，右手握假阴道，集精杯一端向上。假阴道与台畜臀部的关系：对齐、等高、靠紧,第二节 采精,第二节 采精,第二节 采精,（2）手握法：采精员戴上手套握住勃起并已突出剥皮的公猪龟头，缓缓顺势拉出，并有节律的松紧握手，就能采到公猪的精液，在南方全年和北方夏季常采用。（3）筒握法：用普通的假阴道，但前端未装集精瓶，当公猪阴茎插入假阴道后，在假阴道的漏斗部握住公猪的龟头采精。以上两种方法均适用于公

19、猪。,第二节 采精,（4）按摩法采精：采精员用手经直肠壁找到公畜的精囊腺和壶腹腺，轻柔按摩，可达到使公畜阴茎部分勃起而射精。适用于牛、犬和大家畜。,（5）电刺激法采精：通过电极隔直肠壁选择一定的频率通电，刺激输精管壶腹部，是公畜阴茎勃起并射出精液，一般在麻醉状态下进行。此法一般用于未经采精训练或胆小不易控制的动物，如各种野生动物和丧失交配能力但种用价值高的公畜。,第二节 采精,采精频率 指一定时间内对公畜的采精次数（通常为次/周）。合理安排种公畜采精频率的重要性 可维持公畜的正常性机能和保证最大限度地采得足量、优质精液。采精过频会造成射精量小、精子密度下降、未成熟精子增多和公畜性欲降低等不良现

20、象。一旦发现采精过频或其后果已经出现应立即减少采精次数（加大采精间隔）甚至停采。一般观察到尾部有未脱落的原生质滴，说明采精频率过高，应减少或停止采精。,第二节 采精,各种公畜的适宜采精频率牛和水牛 种公牛站通常每周采2次（也可采3次），每次采1或2个射精量（宜间隔1015min）。绵羊 每天可采精14次（前后两次至少间隔2h）；可连续采精，但每周采精总次数不宜超过25次。山羊 每天采精13次。可连续使用，但每周最多可采20次。马、驴 至少间隔1d；也可连采2d，接着休息12d。在配种旺季，可连续采精34d后休息12d。猪 可同马属，但以每周采23次为宜。只要饲养管理条件良好、运动充分，各畜种都

21、可在不引起精液品质降低的前提下适当增加采精次数。,第二节 采精,采精频率是由雄性生产精子的能力决定的。eg.每克睾丸组织每天生产2500万精子，以猪为例，一头公猪一对睾丸约重1000g，一次射精量为250ml，每ml精子数为2亿，则一周精子生产量：2500*1000g*7天=1750亿/周 每次射精精子数：250ml*2=500亿 每周采精次数为：1750亿/500=2.5次,第三节 精液的处理,一、精液采出后的一般处理二、精液品质检查 三、精液的稀释 四、精液保存五、精液的运输,第三节 精液的处理,一、精液采出后的一般处理常规处理保温 精液采出后，要迅速置于30环境中，防止快速降温。标记 精

22、液采出后要及时在精液容器上标明畜种及种畜名称，做到精畜对应，保证来源清楚。,第三节 精液的处理,过滤 猪和马属动物的精液按常规方法采出后，要用无菌的多层纱布过滤，以除去胶质和杂质。过滤器具应无菌并与精液等温。,第三节 精液的处理,二、精液品质检查 概念：即对精液和精子的性状与质量进行评定。精液检查样品的取样要有代表性。精液品质检查的意义鉴定精液质量 以确定能否使用以及为确定稀释倍数提供参考依据；可以反映出公畜的生殖机能和饲养管理的状况；可反映采精技术操作水平 精液量可反映射精是否充分，连同精液是否被污染来反映采精技术熟练程度；检验精液处理的效果 如所用的稀释液是否合适、稀释操作是否得当、精液保

23、存或运输的效果等。,第三节 精液的处理,(三)精液品质检查的内容精液品质检查项目分类：常规检查、定期检查。常规检查 在每次采出精液后进行。精液的外观检查项目射精量（精液量、滤精量）：指公畜一次采精所射出精液的容量。猪和马的精液应过滤后测量。牛：4ml8ml 绵羊：0.8ml1.2ml；山羊：0.5ml1.5ml 猪：150ml300ml（个别个体可达到500ml）马：50ml100ml,第三节 精液的处理,色泽 正常颜色：牛、羊精液呈乳黄色，猪、马、兔为乳白色。气味 家畜精液一般略带腥味，有的动物带有自身的固有气味。气味异常通常伴有色泽的改变。,第三节 精液的处理,云雾状 精液混浊度越大，云雾

24、状显著，颜色越浓，表明精子密度和活率也越高。pH值 新采集的原精液一般PH近中性，牛、羊精液呈 弱酸性（6.56.9），马、猪呈弱碱性（7.47.5）。一般同种精液PH较低的比较好，稀释的精液PH值与品质无太大关系。,第三节 精液的处理,精子活率（活力）：指在显微镜视野内，精液中呈直线前进运动的精子数占精子总数的百分比，与精子受精力密切相关。常用压片标本目测进行评定，一般采用十级评分法。家畜的新鲜精液，精子活率一般在0.70.8左右。应用新鲜精液人工授精的精子活率要求不低于0.6，冷冻保存精液冷冻前活率不低于0.6，解冻后在0.3以上。,第三节 精液的处理,精子密度 指每ml精液中所含的精子数

25、，密度大小直接关系到精液稀释倍数和输精剂量的有效精子数。一般与活力检查同时进行，常用目测法和计数法进行评定。目测法：与检查活率方法相似，精液不做稀释，按照精子密度大小分为密、中、稀三个等级。密：指视野内充满精子，几乎看不到空隙，很难见到单个精子。中：在视野内精子之间有相当于一个精子长度的明显空隙，可见到单个精子活动；稀：视野内精子之间空隙很大，超过一个精子长度的空隙，甚至可查数精子的个数。,第三节 精液的处理,第三节 精液的处理,计数法：用血细胞计数法可准确的测定每ml精液中的精子数量。取1ul精液或其稀释液渗入到血细胞计数板内，计数精子数并根据稀释倍数算出精液密度。,第三节 精液的处理,光电

26、比色计测定法：是目前准确、快捷评定精子密度的一种方法。其原理是根据精子数越多，精子浓度越高，其透光性越低的特性，利用光电比色计通过反射光和透光度来估测精子密度。,（4）死活精子百分率取样的精液进行染色后，在显微镜下计数死活精子所占的百分比，是鉴定精子运动能力的一种方法。其原理是：在特定的染料如伊红-苯胺黑中，活精子不着色，死精子着色，而将死活精子加以区别。活精子的细胞膜为半透状，能阻止色素的侵入，而精子死亡后，细胞膜的通透性增强，容易着色，死亡时间越长，染色时间越深。,第三节 精液的处理,定期检查 精子计数（亿/毫升）死、活精子百分率测定精子畸形率测定 精子顶体完整率的测定,第三节 精液的处理

27、,（3）精子畸形率的计算畸形精子的类型：头部畸形 如巨头、小头、细长、过圆、轮廓不明显、皱缩、缺损、双头等；尾部畸形 如带有原生质滴、中段膨大、纤细、结构不全、双尾、弯曲、屈折等。畸形精子产生的原因：精子发生过程遭到破坏、副性腺及尿道分泌物的病理变化、精液处理不当、精子遭受外界不良影响的刺激等。家畜精子畸形率的允许值（）：牛18，水牛15，羊14，猪18，马12,第三节 精液的处理,第三节 精液的处理,精子畸形率的测定方法：抹片后，用95%酒精固定3min，然后置入蓝墨水（伊红、龙胆紫、美蓝等）中染色5min，再用蒸馏水冲洗干净，自然风干后在显微镜下观察。畸形精子百分率=畸形精子数/计数精子数

28、*100%。,第三节 精液的处理,（4）精子顶体的形态学检查测定精子顶体完整率的意义：更可靠地评定精子的受精力（只有运动状态和顶体结构均正常的精子才具有受精力）。精子的运动能力不能等同于受精能力。呈直线前进运动的精子若顶体结构异常，就不能使卵子受精。精子顶体异常的表现：顶体膨胀、缺损、部分或全部脱落等。,第三节 精液的处理,顶体异常可能的发生原因：精子发生过程受到干扰、副性腺分泌物的性状异常、在体外受到低温打击等。抗冻能力差和冷冻方法不当，必造成顶体结构异常。牛、猪新鲜精液的精子顶体异常率允许值：牛的平均为5.9%，猪的为2.3%。极限值：牛14%（冻精60%），猪4.3%。,第三节 精液的处

29、理,精子顶体率检测方法精液样本制作抹片后，自然干燥后在固定液中固定片刻，水洗后进行姬姆萨染色90120min，再经水洗、干燥后用树脂封装，置于高倍显微镜下观察，一般观察200个精子，计算出顶体异常率。,第三节 精液的处理,其他检查项目 精子存活时间和存活指数检查检查时将稀释后的精液置于一定的温度（05或37）环境下，间隔一定时间检查活率，直至无活动精子或只有个别精子呈摆动活动为止。精子存活时间是指精子在体外一定保存条件下的总生存时间。精子存活时间=检查间隔时间的总和-最末两次检查间隔时间的一半精子存活指数则是通过精子的存活时间与精子活力的变化表示精子活率下降速度的综合性指标。存活指数=每前后相

30、邻两次检查精子活率的平均数与间隔时间乘积的总和一般良好的稀释液05时应在2428h，37 38时应在46h。,第三节 精液的处理,第三节 精液的处理,精子代谢能力测定果糖分解系数测定 精液的果糖分解情况与精子活力密切相关，测定精液果糖分解系数可作为精子活力指标，以1亿精子每小时消耗果糖的毫克数表示。美蓝褪色试验 可测知活精子数并判定精子的活率。原理：精液用美蓝溶液稀释后，精子呼吸时氧化脱氢使美蓝获得氢离子而还原为无色。精子耗氧率测定 耗氧率以1亿精子在37 1h内所消耗的氧气的微升数（l）来表示。精子呼吸时消耗氧气的多少与精子的活力和密度有关。精液微生物学检查（P.167）,第三节 精液的处理

31、,三、精液的稀释 是指在精液中加入适宜于精子存活并能保持其受精力的精液稀释液的技术操作。精液稀释的目的增加容积（扩大精液容量）增加输精的母畜头数。补充营养物质和保护物质 延长精子的寿命。便于精液长期保存和运输 未经稀释的精液不能用于保存。精液通过保存可扩大利用的时空范围，便于异地输精。,第三节 精液的处理,精液稀释液的种类和配制原则 精液稀释液的种类现用稀释液：主要成分为营养剂（糖类或奶类），适用于采集的新鲜精液，采精后立即稀释并进行输精。常温保存稀释液 营养剂及缓冲剂，适用于精液常温短期保存。常温保存稀释液完全可以作为现用稀释液使用 低温保存稀释液 营养剂、缓冲剂、新鲜卵黄，适用于精液低温保

32、存。冷冻保存稀释液 营养剂、缓冲剂、新鲜卵黄、甘油。适用于精液冷冻保存。,第三节 精液的处理,精液稀释液的配制方法和原则 凡进行保存的精液，必须稀释，切忌原精液保存，而且采精后立即稀释。稀释液原则上现用现配；配制稀释液用水应为新鲜、无菌蒸馏水或重蒸水；药品最好用分析纯，称量药品必须准确，充分溶解并过滤；使用新鲜卵黄；稀释液用具必须认真清洗和严格消毒；卵黄及抗生素等必须在稀释液冷却后加入。,第三节 精液的处理,精液稀释液的主要成分及作用 营养剂：供能作用，主要是糖类（果糖、葡萄糖等单糖）以及卵黄和奶类（鲜全奶、脱脂奶或纯奶粉）等。保护剂：缓冲剂：保证精液适宜PH值，利于精子的存活。如柠檬酸钠、三

33、羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）等。抗冷保护剂：精液在冷冻或解冻过程中，精子内外环境的水分，将经历液态和固态转化过程，抗冷物质中的卵磷脂和乳脂的双向亲和性对保护精子不受或减弱冷打击，如 新鲜卵黄、奶类。,第三节 精液的处理,奶类（去脂）的作用大致与新鲜卵黄相同，并可单独用作液态精液稀释液（山羊的精清中含有磷脂酶、类磷脂酶、磷酸酶等许多物质,当与卵黄接触后会使卵黄凝固,产生对精子有毒害和损伤作用的物质,致使精液酸度增高,造成精子死亡，一般羊奶可用于羊的精液）抗冻保护剂：可以提高精液冰点，少量渗入精子可降低冷冻损伤（减少冰晶形成），从而达到抗冻作用，如甘油和二甲基亚砜（DM

34、SO，对精子的毒性较大）。,抗菌素类：抑制精液中和操作中带入的微生物的繁殖。如青霉素、链霉素、硫酸新霉素、林肯霉素、氨苯磺胺（结晶磺胺即外用消炎粉）等。其他：酶类：如过氧化氢酶、-淀粉酶促进精子获能，提高受胎率。激素类：催产素、前列腺素可促进母畜生殖道蠕动。维生素类：VB1、B2、B12，VC等，能提高精子活率,第三节 精液的处理,精液的稀释原则与注意事项 等温稀释 精液和稀释液的温度要一致或相近（允许相差5以内）。稀释操作的方向 要把稀释液沿着精液容器的壁缓慢地加入到精液中，而且要一边加稀释液，一边轻轻地晃动精液容器，使之及时混匀。稀释倍数高倍稀释要分步进行 不超过倍时，可进行一步稀释；若需

35、进行高倍稀释，则应分步进行前一步稀释后应停数分钟，经镜检符合继续稀释的要求时再行下一步稀释，每一步只稀释2倍。,第三节 精液的处理,精液的稀释倍数 精液稀释倍数应依原精液的品质和输精的要求而定，必要时（如制作冷冻精液）可依下列公式进行计算：其中，预期的输精后精子活率：鲜精：马、猪0.6，牛、羊0.7；冻精：牛0.3（0.35），山羊0.4。在上式中，稀释倍数包括原精液量所占的1份在内（生产中的稀释倍数通常指稀释液的添加份数）。,第三节 精液的处理,各畜种精液的经验稀释倍数：牛540、水牛520，猪、羊24，马、驴23，兔35。在生产上，一般的做法是若原精液的品质极好、输精的母畜头数较多，可多稀

36、释几倍，反之可低倍稀释。,第三节 精液的处理,第三节 精液的处理,四、精液保存（semen preservation）概念：精液经适当稀释后，放置在一定的条件下，使精子的代谢活动受到抑制而延长存活时间，且不损害其受精力，从而达到扩大精液利用的时空范围的精液处理方法叫做精液保存。目的：为了延长精子的存活时间，便于运输，扩大精液的使用范围,第三节 精液的处理,精液保存容器应具备的条件 不溶性 精液容器的制作材料不会在与精液接触后发生溶解。无毒性 精液容器的制作材料必须对精子安全、无毒，且要符合环保要求。密封性 保证能够进行确实可靠的密封，使精液与空气相隔绝。避光性 避免精子受到光线照射的危害。廉价

37、性 生产成本低，易于制作和推广。,第三节 精液的处理,精液保存的方法液态保存常温保存低温保存冷冻保存（超低温保存）,第三节 精液的处理,液态保存 常温保存保存温度：一般畜种的精液保存在1525的环境里，猪精液的保存温度为1520在此情况下，精液的保存温度不一定很低，且允许在一定的范围内变动，所以常温保存也叫变温保存。,第三节 精液的处理,保存原理精子的活动在弱酸性环境中受到抑制，能量消耗降低，一旦pH值恢复到中性左右，精子又可复苏。因此，在精液稀释液中加入弱酸类物质，创造一定的酸性环境，以抑制精子的活动，或用明胶阻止精子运动，使精子保持在可逆性的静止状态而加以保存。一般认为有机酸较无机酸效果好

38、。常温保存有利于微生物的生长繁殖，因此加入抗菌素。此外，加入必要的营养物质（糖类）。,第三节 精液的处理,精液常温保存条件的控制：可放在恒温常温冰箱内（市售品温度通常设置为17），夏季也可放在水井里或加凉水的保温瓶里（注意必须密封严，不能让水漏进去；放进保温瓶内保存者，还应注意定时检查水温和更换凉水）。保存期限：一般为数天（牛15d，马25d，猪35d，绵羊1d）。精液采用常温保存，设备简单，又便于输精，故适于普及推广。,第三节 精液的处理,低温保存 保存温度：猪510，其它畜种05精液低温保存稀释液：要含有卵黄或奶类等抗冷保护剂。原理：精液稀释后缓慢降温至05保存，利用低温来抑制精子活动，降

39、低代谢和能量消耗，抑制微生物生长，以达到延长精子存活时间的目的。当温度回升后，精子又恢复正常代谢机能并维持其受精能力。为避免精子发生冷休克，在稀释液中须加卵黄、奶类等抗冷物质，并采用缓慢降温的方法。,第三节 精液的处理,低温保存的条件 冬季置于不结冰的室内（温度要符合要求），其它季节可放在冰箱内或加有凉水的保温瓶内保存。精液低温保存技术 降温处理：降温速度不可过快（从30降到510，约需12h）。降温时要先把精液瓶包好，置于等温的水浴环境中，再放在设定的保存温度下缓慢地降温。在生产中，为了提高工作效率，一般采用直接降温法，即将分装有稀释精液的试管，包上数层纱布或棉花，再装入塑料袋内，直接放入冰

40、箱或保温瓶中。,第三节 精液的处理,精液低温保存的注意事项降温速度不可过快（通常按0.2/min）。保存期间，尽量使温度保持恒定，避免升温。低温保存的精液在镜检和使用前，要通过水浴升温到30以上。低温保存的猪精液在镜检和使用前，必须升温并伴以充氧）。,第三节 精液的处理,冷冻保存精液冷冻保存的原理 精液用含有抗冻保护剂的稀释液稀释后，主要利用液态氮（-196）作为冷源，在深度冷冻状态下进行保存，精子的代谢活动完全受到抑制；当以适当速度升温到0以上时就能复苏，且仍保持受精能力。精子在冷冻过程中，在抗冻保护剂的作用下会尽可能形成玻璃化，防止了精子细胞内水分的冰晶化所造成的破坏作用。,第三节 精液的

41、处理,（2）冷冻保存的意义充分提高优良种公畜的配种效率，加快畜群品种改良步伐；便于冷冻精液的自动化生产；便于引种；推进繁殖新技术的应用；建立动物基因库。,第三节 精液的处理,（3）精子的冻害精子冻害的种类及其产生原因a.化学性伤害 渗透压升高而导致的溶液效应。冰晶化，其是水在降温过程中的一定温度条件下，水分重新按几何图形排列形成冰晶的过程。可使精子膜内的溶质浓度和渗透压升高，水由精子内向外渗透，造成精子细胞脱水，使精子发生不可逆的化学毒害而死亡。b.物理性伤害 精子内部水分形成冰晶，其体积增大且形状不规则，由于冰晶的扩展和移动，造成精子膜和细胞内部结构的机械损伤，引起精子死亡。,第三节 精液的

42、处理,冰晶形成的规律 冰晶形成于-0.6-60范围内（冰晶化温度域），降温速度越慢，形成的冰晶越大，对精子的伤害越严重。尤以在-15-25（危险温度域）形成的大量大冰晶对精子的危害最严重。解冻过程对精子的影响 在解冻过程中，冰晶融化对精子质膜产生压力；若温度波动，会导致细胞内水分重结晶而加重冻害。,第三节 精液的处理,防止精子冻害的技术措施借助于抗冻保护剂（如甘油）阻止水分子形成大冰晶。用合理的高渗稀释液稀释精液，以适度减少精子体内游离水分的含量（减少冰晶数量和冰晶的体积）。在降温和升温过程中快速通过有害温度区。,第三节 精液的处理,抗冻保护物质常用的是甘油，也可使用其他的多羟基化合物，最早还

43、有使用二甲基亚砜（DMSO）的。二甲基亚砜对精子生活力的保护效果好（解冻后精子复苏率高），但对顶体有较大的毒害作用（影响顶体结构）。,第三节 精液的处理,冻精稀释液中甘油的应用甘油的抗冻原理：一是可降低精液的冰点；二是其OH基与水分子形成氢键，能够阻止大块冰晶的形成。甘油对精子的毒害作用：吸水性强，浓度过高时会对精子产生毒害作用，如精子皱缩、顶体结构受损、酶系破坏、颈部损伤、尾部弯曲变形等。常见畜禽冻精稀释液中甘油的使用浓度（）：牛57，水牛58，马3.54，驴5，猪13，山羊78，绵羊35，兔56；鸡1417。,第三节 精液的处理,甘油平衡：指精液用含有甘油的冻精稀释液稀释后，缓慢降温至45

44、，并在此环境中放置一定时间，使甘油与精子充分作用，以提高精子的耐冻性的处理过程。甘油平衡的时间长度有物种间的差异，一般家畜的精液通常为24h，但有进一步缩短的趋势或可能（2005年上实验课时鸡的精液稀释后未经甘油平衡就冷冻，解冻后仍有复苏的）。,第三节 精液的处理,（4）冷冻精液的剂型与保存温度冷冻精液的保存温度：-195.8（液氮，应用广泛）-79（干冰。缺乏液氮供应地区适用）液氮的特性：理化性质：氮是无色、无味、无毒害气体。当温度降到-196时，氮气即变成液态；当吸收外界热量时会沸腾，变成同温度的气态氮。超低温性：液氮的沸点是-196。膨胀性：液氮是有空气中的氮气压缩冷却制成的，随温度升高

45、，体积会增大，当温度达15 时，1L液氮可气化为680L氮气。,窒息性：氮气也称为窒气。当室内氮气超过78%时，可使室内空气中氧气的浓度下降至1316%，进而对人体有危害作用。抑菌性：液氮本省无杀菌能力，在-196 的超低温下，可抑制多数细菌、病毒的繁殖。,液氮容器：用于储存冷冻精液和储存、运输液氮。有大容积的液氮槽、液氮车，也有小容量的运输液氮罐。液氮罐结构：由外壳、内层、夹层、颈管、盖塞、储精提桶及外套构成。,液氮罐的使用：液氮的添充：首次使用时，要预冷。当液氮消耗掉只有1/2时，即应补充液氮。储存及取用精液：储存精液时必须迅速放入经预冷的储精提桶内，浸入液氮面以下。颗粒冻精可装入纱布袋或

46、小瓶内，浸入液氮。取用精液时操作要敏捷迅速，一般要求从底部提至颈部在5s内完成。液氮罐的保养：应放置于凉爽、干燥、通风良好的室内，使用过程中防止碰撞。注意保护盖塞和罐的颈管部，此部分脆弱易于损坏。罐体不可横倒放置。每年清洗一次，空罐放置两天后，用4050 中性洗涤剂擦洗，冲洗干净并干燥后使用。,冻精剂型及其优缺点：细管精液：将稀释后的精液平衡后利用分装机分装于0.250.5ml剂量经过标记的无毒塑料细管中，封口冷冻后制成。每个输精剂量有效精子数不少于 1000万。（有效精子0.1亿/0.25ml。全球通用）。优缺点：细管冷冻精液需要专门的机器操作，打印、分装、封口、冷冻一次完成。细管型精液剂量

47、准确，卫生条件好，质量稳定，冻后活力高，使用方便，还可以减少在空气中或在液氮保存中的污染，输精时利用专门的输精枪，不需解冻液，直接解冻便可应用。其缺点是，全套机器价格昂贵，小型冻精站不便推广。,颗粒冻精：颗粒型冷冻精液是发展中国家和我国普遍采用的一种类型。颗粒型冻精是将稀释、平衡后的精液在-80-120 下冻结成颗粒状，每个颗粒为 0.1毫升，解冻后的输精剂量有效精子数不少于1200万。优缺点：颗粒型冷冻精液最大优点是，冷冻时不需很多设备，冻后贮存方便；缺点是手工操作，易造成污染。,安瓿（ampoule）冻精：是操作比较简单的一种类型。将稀释后的精液分装于0.51ml的玻璃安瓶中，每个输精剂量

48、有效精子数不少于1500万，平衡后进行冷冻。优缺点：优点是操作比较方便，不易被污染；但标记麻烦，贮存时占用体积大，现在已逐渐被颗粒型和细管型所替代。,各种动物的冻精剂型：牛、羊：细管精液，颗粒冻精，安瓿冻精马属动物：大颗粒状。猪：大颗粒状或饼状。其他动物：颗粒冻精。,第三节 精液的处理,（5）冷冻前精液的稀释方法 一次稀释法：用含甘油的稀释液一次等温稀释到最终浓度。通常适用于制作颗粒冻精，也用于细管精液、安瓿冻精。二次稀释法：分两步进行稀释，可减轻甘油对精子的化学毒害作用。先用不含甘油的稀释液稀释到最终浓度的1/2，并经11.5h降至45，再用含甘油的稀释液稀释至终浓度。常用于细管精液，也用于

49、安瓿冻精。,第三节 精液的处理,（6）冷冻精液生产与贮用的一般流程,第三节 精液的处理,（7）冷冻精液的保存与解冻浸没于液氮中贮存 液氮耗至1/2时应及时补充，耗至1/3则必须立即补充。检查液氮余量：称重法、尺量法。冻精的存取操作：镊子预冷；在罐口下10cm处操作，冻精离开液氮面不得超过10s。冻精的容器间转移操作不得超过5s。,冻精的解冻：不同畜种及剂型的冷冻精液，其解冻温度和方法有差别。牛：细管精液：382水浴中晃动至颜色变成透明。颗粒冻精：解冻管内装入适量解冻液（2.9%柠檬酸钠液）水浴解冻至融化。羊：细管精液：直接浸入不低于20水浴中摇动8s，取出待全部融化。颗粒冻精：放入灭菌小试管中

50、，没管一粒，迅速置于7080 的水浴中融化一半，取出后在手心中轻轻搓动至融化。,猪：一般按一个输精量解冻，温度为5060 为好。原则上，输精前解冻，解冻后精子活率不低于0.3，解冻后即输精，一般解冻后至输精的时间间隔最长不超过13h(最大时限：细管精液1h，颗粒精液2h)。解冻后，随着温度升高，精子受精力急剧降低（活力会提高）。,五、精液的运输 目的运输方式液态运输精液的包装 远距离运输的液态精液温度控制措施液态精液运达后的处理,第三节 精液的处理,目的 用于精液的异地使用（交流、销售、输精）。运输方式 各种交通工具均可。液态运输精液的包装 冷冻精液 浸入液氮中。液态精液按头份或需要量分装；精