《DNA重组技术的基本工具》讲稿.ppt

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1、一、基因工程的概念：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因重组,生物体外,基因/DNA,分子水平,剪切拼接导入表达,人类需要的基因产物,1.限制酶和DNA连接酶的作用分别是什么?,限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,DNA连接酶的作用是连接被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,问题探讨：,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育

2、出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,2.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有?,提示：从噬菌体侵染细菌中获得灵感,原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制性核酸内切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而保护自身的作用。,A,A,T,T,G,C,C,T,T,A,A,G,磷酸二酯键,磷酸二酯键,如何切割DNA分子呢？,切割DN

3、A分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1、来源主要是从原核生物中分离纯化而来,（流感嗜血杆菌）,2、功能一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。,限制酶的识别序列：,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,重复演示,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端平末端,要想获得目的

4、基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,要把目的基因插入运载体的前提是什么,必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。,思考?,模型构建1,练习使用EcoRI 剪切目的基因,黏性末端,二、“分子缝合针”DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,模型

5、构建2,使用DNA连接酶制作重组DNA分子,甲片段,重组DNA分子Recombinant DNA,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,2DNA连接酶(1)常用的DNA连接酶,.DNA聚合酶与DNA连接酶是同一种酶的不同名称吗?,问题:DNA复制时需要哪些酶?,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载体：细菌的质粒 噬菌

6、体或某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,2、作用 将外源DNA携带进受体细胞后，停留在细胞中进行自我复制或整合到染色体上，随染色体DNA进行同步复制。质粒DNA分子上有特殊的遗传标记基因，如抗四环素、氨苄青霉素等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。,3、其他载体 噬菌体、动植物病毒,在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其

7、中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对受体细胞生存没有决定性作用，但复制只能在受体细胞内完成。,质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并且具有自我复制能力的双链环状DNA分子。,质粒是基因工程最常用的载体。,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,习题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么?请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,达尔文提出生物进化论

8、,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,克里克等提出中心法则,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明,为什么限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？,1、DNA分子不含限制酶的识别切割序列；2、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使了限制酶不能切开。,