《DNA的粗提取与鉴定》课件.ppt

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1、DNA的粗提取与鉴定,讨论2：如何证明他们是遗传物质？,讨论3：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？,讨论1：构成生物体的遗传物质是什么？,1、提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2、生物大分子主要指蛋白质、酶和核酸,3、提取DNA的基本思路利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分,（一）提取DNA的方法,（1）DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol

2、L时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,（2）DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离,（3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而DNA在80C以上才会变性洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响,1、在沸水浴中，DNA遇二苯胺会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定D

3、NA的试剂,（二）DNA的鉴定,2、甲基绿（绿色）,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,（三）除去滤液中的杂质(纯化),（四）DNA的析出与鉴定,二、实验设计,（一）实验材料的选取,1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,2、原则：选用DNA含量相对较高、容易提取的生物组织。,鸡血,3、合适的材料：,原因：一是鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水涨破。,动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,

4、（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，从而释放出DNA。,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,2、植物细胞植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜,实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,具体做法：10mL鸡血20mL蒸馏水同方向搅

5、拌3层尼龙布过滤滤液,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质,（三）去除滤液中的杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L

6、的NaCl溶液溶解DNA。,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离,方案二、直接在滤液中加入嫩肉粉，反应1015分钟。方案三、将滤液放在60750C的恒温水浴箱中保温1015分钟。,为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质,具体做法:方案一：30mL滤液35gNaCl同方向搅拌，DNA溶解加入蒸馏水DNA析出过滤得到过滤物放到2mol/LNaCl溶液中溶解DN

7、A-NaCl溶解液方案二：30mL滤液嫩肉粉（木瓜蛋白酶）静置1015分钟DNA滤液方案三：30mL滤液6075处理过滤获得DNA滤液,（四）DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95），静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。,1、DNA的析出,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看

8、溶解有DNA的溶液是否有蓝色,2、DNA的鉴定,在沸水中加热的目的：加快颜色反应的速率,沸水加热：说明DNA对高温具有较强的耐受性,1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。,制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同一方向搅拌过滤，除去细胞壁、细胞膜等。溶解核内DNA加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅

9、拌DNA析出加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L 溶液中除去细胞质中的大部分物质。DNA初步纯化与等体积95冷却酒精混合，析出白色 丝状物除去核蛋白、RNA、多糖等。DNA鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色,实验操作,2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 molL和0.14 molL对DNA有何影响?,1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是()。A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,答：B,答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出,3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成()A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色,4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液?,答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。,答：D,