《DNA序列分析》课件.ppt
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1、第九章 DNA序列分析,第一节 Maxam-Gilbert化学降解法第二节 Sanger链终止法第三节 DNA片段序列测定的策略第四节 核苷酸序列的生物信息分析,第一节 Maxam-Gilbert化学降解法,化学降解法:人们用专一性作用于A、T、G、C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段,通过控制反应时间,既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。除了要研究与DNA的高级结构、DNA-蛋白质结构相关性采用化学降解法外,对于单纯以测序为目的的实验,普遍采用后面所讲的酶促合成法。,第二节 Sanger链终止法,1977年Sanger设
2、计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法,进行DNA序列测定,即双脱氧链终止法。Sanger法获得诺贝尔化学奖。一、Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下,DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端,使引物延长,合成出新的互补的DNA链,如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基,故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA,从而读取DNA核苷酸序列。,二、双脱氧
3、终止法测序反应体系:,DNA聚合酶单链DNA模板带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种dNTP(aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4种ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP),Sanger法DNA测序的试剂 引物:通常由20-23个碱基构成,G+C=12,A+T=8到11,Tm=60-68,避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 模板 DNA聚合酶 2,3-双脱氧核苷三磷酸(2,3-dideoxynucleoside triphosphate,ddNTP)dNTP三、测序反应的种类 引物标记法(Dye primer reactions)终止物标记法(Dye ter
4、minator reactions),This figure shows the structure of a dideoxynucleotide(notice the H atom attached to the 3 carbon).Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction.Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.,This figure is a representation of a
5、n acrylamide sequencing gel.Notice that the sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand,5 to 3,is AATCTGGGCTACTCGGGCGT,测序过程:1.模板与引物杂交2.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入:DNA聚合酶、dNTPs、标记引物终止剂不同:ddA、ddG、ddC、ddT四个试管中所有产物是
6、一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3.电泳:ACGT次序,高压电泳4.放射自显影得到直读图象,第三节 DNA片段序列测定的策略,人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱趋于完成,人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展,测序策略的成熟、测序方 法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高,大大推进了大规模DNA测序的进程。一、定向测序策略 定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析。传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序,然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析。,二、随机测序战略 随
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