高美华《医学免疫学》elisa.ppt

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1、医学免疫学实验（三）免疫标记技术,张蓓,检测Ag-Ab的体外实验,1,2,3,凝集反应,沉淀反应,免疫标记技术,标记免疫技术=,灵敏性,特异性,免疫技术+标记技术,常用的免疫标记物质,类别 标记物 用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定,分 类,主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性 酶对底物的催化活性,抗原抗体反应

2、的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,ELISA 原理及特点,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法（双位点一步法）测甲胎蛋白（AFP）,【临床意义】significance in clinical practise,1、原发性肝癌的大规模普查,2、可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤,一、ELISA双抗体夹心法测AFP原理,用抗AFP抗体包被

3、固相载体，加入待检标本，标本中的AFP与固相载体上的抗体结合，再加入酶标记的抗AFP抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，颜色的深浅与相应AFP的量呈正相关。双位点一步法：包被抗体和酶标抗体分别是抗AFP不同位点的McAb,ELISA原理图,【实验原理】Experiments mechanism,principle,抗AFPMcAb抗体,抗AFPMcAb抗体,AFP,双位点一步法：抗AFP不同位点的McAb,二、试剂材料,1、AFP检测试剂盒2、AFP参考标准液（0、25、50、100、200、400ng/ml）。3、DW4、终止液（2M H2SO4）。5、酶标测定仪、37温箱。6

4、、微量加样器、滴管、吸水纸等。,三、method,（一）quantity test1、add sample 取包被好的酶标孔7孔，进行标记，第16孔分别加入AFP参考标准夜（0、25、50、100、200、400ng/ml）各100ul。第7孔加入样品100ul。3720分钟2、wash：在各孔中加入洗液2滴,轻轻摇动几下,弃之,然后用蒸馏水或自来水加满各孔,甩掉,反复5次,最后在吸水纸上拍干.3、每孔加酶结合物2滴，3715分钟。4、wash5、显色每孔加底物和显色液各1滴，轻轻振摇，室温避光反应5分钟，加入2滴终止液终止反应。5、酶标仪450nm比色，计算结果。,（二）quality te

5、st1Add sample取包被好的酶标板3各孔，分别加入阴性对照（25 ng/ml）、阳性对照（400 ng/ml）和待检标本各100ul 3720分钟。2、wash：在各孔中加入洗液2滴,轻轻摇动几下,弃之,然后用蒸馏水或自来水加满各孔,甩掉,反复5次,最后在吸水纸上拍干.3、每孔加酶结合物2滴，3715分钟。4、wash5、显色每孔加底物和显色液各1滴，轻轻振摇，室温避光反应5分钟，加入2滴终止液终止反应。,四、result,1Quantity test用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值，以OD值为横坐标，AFP含量为纵坐标

6、，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的OD值在标准曲线上查出相应标本的AFP含量。2Quality test在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔色泽深于阳性对照孔则AFP400ng/ml，阳性；若待检样品孔色泽深于阴性对照孔而浅于阳性对照孔则20ng/mlAFP400ng/ml，弱阳性；待检样品孔色泽浅于阴性对照孔则AFP 20ng/ml，阴性。参考范围：正常成人AFP含量20ng/ml。,【实验结果】Experiments results,若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为,阴性,阳性,弱阳性,五、Report,1简述ELISA原理及ELISA双抗体夹心法测AFP原理。2记录实验结果。,