《生物化学教学课件》第四章(一)生化.ppt

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1、第二章,蛋 白 质 化 学,第一节 概 述,一.蛋白质是一种重要的生物大分子 18世纪中叶，Beccari首次报道了从面粉中能分离到一种粘性很高的物质，现知为谷蛋白。尔后的一系列研究都证明，应用稀酸、稀碱、盐类都可从植物、动物组织中分离到类似的物质。,19世纪中叶,荷兰化学家Gerardus Mulder 从动植物体中提取得到一种共有的物质。根据瑞典化学家Berzelius的提议，Mulder 将之命名为Protein（由希腊文 Proteios而来，意指“第一重要的”。,100多年前，革命导师恩格斯就指出：“无论在什么地方，只要我们遇到生命，我们就发现生命是和某种蛋白体相联系的，并且无论在什

2、么地方，只要我们遇到不处于解体过程的蛋白体，我们也无例外地发现生命现象。”,迄今为止的研究证明，蛋白质是细胞中含量最高的组分之一。蛋白质是组成简单、分布广泛、同时又是结构和功能多样化、种类最多、最为活跃的一类生物大分子。其分子质量为D，由20种氨基酸以特定的排列组合形成不同的多肽链，各种多肽链又折叠成不同的空间构象。,蛋白质结构上的多样性 决定其功能上的多样性,酶蛋白催化细胞内几乎所有的化学反应，控制生物的新陈代谢。如淀粉酶等。运输蛋白负责在细胞间与细胞器之间转运小分子和离子。如血红蛋白。,运动蛋白负责生物机体的组织、器官或整体的运动。如肌动蛋白。调节蛋白调节有机体的各种新陈代谢。一如激素，如

3、胰岛素。二如参与基因表达调控的蛋白。贮藏蛋白贮藏营养。如大豆球蛋白。,防御蛋白防御致病微生物或病毒的侵入。如免疫球蛋白。结构蛋白具有很强的抗张力作用，对机体的组织、细胞起机械支撑作用。如动物的皮肤与骨骼中广泛存在的胶原蛋白以及动物的毛、发、角、爪中的角蛋白。,受体蛋白接受和传递调节信息。如钙调蛋白。毒蛋白侵入动物体内能引起中毒症状甚至死亡。如蛇毒。,异常功能蛋白应乐果甜蛋白有极高的甜度，可做人工增甜剂；昆虫翅膀的结合部的节肢弹性蛋白，有特殊的弹性；支架蛋白通过蛋白-蛋白相互作用识别并结合其它蛋白中的某些结构元件，将多种不同的蛋白质装配成一个复合体，参与对激素和其它信号分子胞内应答协调和通信。,

4、二.蛋白质的化学元素组成,蛋白质是一类含氮有机化合物.除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其它一些元素，主要是磷、铁、碘、锌和铜等。,这些元素在蛋白质中的组成百分比,碳 50 氢 7 氧 23 氮 16%硫 03 其它 微 量。,蛋白质中氮元素的平均含量为16%这是蛋白质元素组成的一个特点！这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的根据。样品中蛋白质含量(g)=氮含量(g)6.25（即100/16）,第二节 氨基酸,1819年，法国化学家布拉孔诺（H.Braconnot)把纤维素放在酸里加热，成功地把纤维素水解为葡萄糖，从而知道纤维素是由许许多多的葡萄糖“手拉手”组成的。他想，能不能像研

5、究纤维素那样来研究蛋白质的组成呢？,首先，他把明胶放在酸里加热，结果从酸水解液中分离到一种分子量比蛋白质小得多的含氮化合物，后来取名为甘氨酸；他又用同样方法从肌肉水解液中提取出另一种含氮化合物，因它的结构中含氨基和羧基，故取名为氨基酸。,现已确证，蛋白质的基本组成单位是氨基酸。迄今为止，在各种生物体内已发现了180多种氨基酸（又说是超过200种）。但是，只有20种蛋白质氨基酸。,氨基酸是蛋白质的基本结构单位，故又叫构件分子。所有生物都以相同的20种氨基酸作为蛋白质的结构单位，故这些氨基酸也叫标准氨基酸。这些氨基酸是由基因编码的，故又叫编码氨基酸。,近几十年的研究发现，在原核与真核生物的少数蛋白

6、中还有第21种氨基酸，硒代半胱氨酸，其半胱氨酸中的硫被硒取代。在微生物中还有第22种氨基酸，吡咯赖氨酸。这两种氨基酸也属于编码氨基酸。,一.氨基酸的一般结构特点,蛋白质的20种基本氨基酸，除脯氨酸是一种-亚氨基酸外，其余的都是-氨基酸。除甘氨酸外，其它蛋白质氨基酸均为L-型氨基酸。,这些氨基酸中，它们分子中的a-碳（分子中第2个碳，Ca）结合着一个氨基和一个酸性的羧基。此外，Ca还结合着一个H原子和一个侧链基团（用R表示）。每一种氨基酸的侧链基团R都是不同的。,手性碳,二.氨基酸的分类与结构(1)根据氨基酸分子中所含氨基和羧基数目的不同，可将组成蛋白质的20种氨基酸分为三大类：中性氨基酸，分子

7、中含一个氨基，一个羧基；酸性氨基酸，分子中含一个氨基，两个羧基；碱性氨基酸，分子中含一个羧基，两个氨基。,(2)根据侧链R基团极性性质分类 非极性R侧链氨基酸；在生理pH条件下，极性带电荷的氨基酸；在生理pH条件下，极性不带电荷的氨基酸。,三蛋白质中不常见的氨基酸修饰性氨基酸,除上述20种氨基酸外，有些蛋白质中尚含有少数特殊的氨基酸，也叫稀有氨基酸。它们在蛋白质中出现的机率小，往往是标准氨基酸的衍生物。它们无自己的密码子，是在蛋白质合成后经氨基酸修饰后形成的，有重要的生物学意义。它们属于非标准氨基酸。,如弹性蛋白和胶原蛋白中含有羟脯氨酸和羟赖氨酸（5-羟赖氨酸）；-羧基谷氨酸，存在于凝血酶原中

8、。哺乳类动物的肌肉中存在N-甲基甘氨酸（肉氨酸）；酪蛋白中存在磷酸丝氨酸等。肌球蛋白和组蛋白中含有6-N-甲基赖氨酸；,世界上凡是可食的东西，都有自己特有的味道。氨基酸也不例外。许多山珍海味，给人以美味的感觉享受，莫不与氨基酸的存在有关。大米的香味是由于胱氨酸的存在，而啤酒的苦味，其原因之一是由于三个支链氨基酸的存在。,四非蛋白质氨基酸,除了上述的氨基酸外，自然界中还存在许多的氨基酸。它们多以游离状态存在于生物的某些组织或细胞中,不参与蛋白质的组成。它们也是天然存在的氨基酸,大多为蛋白质氨基酸的衍生物。它们也属于非标准氨基酸。,很多非蛋白质氨基酸的功能尚不很清楚,有的是某些代谢过程的中间产物或

9、重要代谢物的前体；有的可调节生长；有的可影响某些农产品的品质；有的可能在体内起杀虫杀菌的作用；,非蛋白质氨基酸的一个代表牛磺酸,它首先发现于牛黄，在神经系统中也很丰富。先是发现它为婴幼儿和动物早期大脑以及视力发育所必需，继而发现它能降低血脂、胆固醇、血糖及血压，还能改善心肌缺血，防治心律失常。由于它能够促进婴幼儿的生长发育、老年的保健，在上世纪八十年代，就取得了 FDA（食品药品监督管理局）的认证，列入食品添加剂。,它能防治高血压、中风、糖尿病，成为现代人抵抗疾病的四大杀手之一和健康卫士。近几年间，牛磺酸在婴幼儿奶粉、老年保健品中被广泛应用，因此其需求用量大增，已突破万吨，尚供不应求。,五.D

10、-氨基酸研究进展,D-氨基酸在生物界普遍存在，尤其植物组织中。在微生物体内存在的D-氨基酸，多以结合态存在。如短杆菌肽S中存在D-苯丙氨酸，多粘菌肽中含D-丝氨酸和D-亮氨酸。青霉素分子中的D-半胱氨酸若换以L-型的，则失去抗菌效能。,动物体内的D-氨基酸多以自由态形式或小肽形式存在。如家蚕血液和蚯蚓体内含有D-丝氨酸。人牙齿蛋白中含有D-精氨酸，它的含量变化与人的年龄及衰老有关。,D-氨基酸的存在与某些蛋白质的功能密切相关,萤火虫尾部的发光物质荧光素，含有D-半胱氨酸。如果代之以L-半胱氨酸，则不能发光。现在，人们可以用D-氨基酸合成蛋白质。这类蛋白质是天然蛋白质的镜像结构，故人们称之为“D

11、-生命”。,六氨基酸的一般性质,氨基酸均为无色结晶体或粉末状，每种氨基酸都有自己特有的结晶形状，可用于鉴定。与相应的有机酸比较，氨基酸的熔点较高，一般都大于200。如甘氨酸的熔点为232，而相应的乙酸的熔点为16.5。,在可见光区氨基酸均无吸收,在近紫外区（220-300nm），苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸都有吸收，由于三者结构上的差异，其最大光吸收波长不同。酪氨酸的最大吸收波长（max）为275-278nm，苯丙氨酸为257-259nm，色氨酸为279-280nm。,组成蛋白质的氨基酸，除甘氨酸外，均含有不对称碳原子，故具有旋光性。在一定的温度和溶剂系统中，不同的氨基酸都有各自的比旋光值，可用于

12、定性鉴定。,有些氨基酸，如苏氨酸、异亮氨酸等，含有两个不对称碳原子，因此有四个非对映异构体:其中两个分别称为L-和D-型，另外两个称为L-别和D-别，所以有别苏氨酸、别异亮氨酸等名称。,除胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸外，氨基酸一般溶于水。但在稀酸、稀碱中溶解最好。除脯氨酸溶于乙醇、乙醚外，绝大多数氨基酸都不溶于有机溶剂，故可用有机溶剂沉淀法生产氨基酸。脯氨酸极易溶解于水中，故易潮解不易制成结晶。,七氨基酸的化学性质,氨基酸的化学性质是由它的结构决定的。不同氨基酸之间的差异仅在侧链上，故它们具有许多共同的性质。个别氨基酸由于侧链的特殊结构尚有许多特殊的性质。,1.氨基酸的解离性质,氨基酸在结晶形态或

13、在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。,在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,pH 1 7 10净电荷+1 0-1 正离子 两性离子 负离子 等电点pI,2.氨基酸的等电点,当溶液为某一pH值时，若氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，则氨基酸分子的净电荷为0。此时，这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。,在等电点时，氨基酸既不向正极也 不向负极移动，即氨基酸处于两性离子 状态。,设 K是表观解离常数 K1 表示-C上-COOH的表观解离常数,K2

14、表示-C上-NH3+的表观解离常数。,氨基酸 pI 的计算,侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是两性离子两边的pK即pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2 碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2,An acidic amino acid pI=(pK1+pKR)/2,A basic amino acid pI=(pKR+pK2)/2,3.氨基酸的主要化学反应,（1）茚三酮反应（ninhydrin reaction）在pH 5

15、-7和80-100条件下，大多数-氨基酸和茚三酮（乙醇）溶液反应形成蓝紫色的化合物，并放出氨和二氧化碳。这是-氨基酸特有的反应；氨基酸与茚三酮反应产生的蓝紫色化合物在570nm有最大吸收。,茚三酮反应,氨基酸与茚三酮（ninhydrin）的反应是一个检测和定量测定氨基酸和蛋白质的重要反应。,这可用于定量测定，但不能作为惟一定量测定的依据，因有氨等化合物的干扰。要定量测定，可测定放出的二氧化碳的量，因为只有氨基和羧基连在同一个碳原子上的化合物与茚三酮反应才放出二氧化碳。,谷氨酰胺和天冬酰胺有酰胺基，与茚三酮反应产生棕色化合物。而脯氨酸与羟脯氨酸含-亚氨基，与茚三酮反应形成黄色的产物，在440nm

16、有最大吸收，可定量测定。反应中无氨的释放。氨和胺类也与茚三酮反应，但不放出二氧化碳。,（2）（与）亚硝酸反应,这也是-氨基所特有的反应。氨基酸与亚硝酸反应放出氮气，其中的一个氮原子来自氨基酸，另一个则来自亚硝酸。,该反应是Van Slyke氏氨基测定的理论基础。此反应可用来判断蛋白质的水解程度，蛋白质水解愈完全，放出的-氨基酸愈多，与亚硝酸反应放出的氮愈多。脯氨酸含-亚氨基，故无此反应。,（3）与2，4-二硝基氟苯反应,在弱碱性（pH 8-9）、暗处、室温或40 条件下，氨基酸和2，4-二硝基氟苯反应生成黄色的二硝基苯氨基酸（dinitrophenylamino acid，简称DNP-氨基酸）

17、。,该反应由F.Sanger首先发现，并用于鉴定多肽或蛋白质的N-端氨基酸。此即Sanger反应。,除-氨基外，酚羟基、-氨基、咪唑基也有反应，但其反应的产物在酸性条件下，不溶于乙醚、乙酸乙酯，而留在水相中。,（4）与苯异硫氰酸（PITC）的反应,在弱碱性条件下，氨基酸与苯异硫氰酸反应生成苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在酸性条件下，生成的PTC-氨基酸环化而转变为苯乙内酰硫脲氨基酸，简称PTH-氨基酸。瑞典科学家Edman首先使用该反应测定蛋白质N-末端的氨基酸。此即Edman反应。,a-氨基和羧基参与及其它的反应（参考）,第三节蛋白质的结构,自然界存在的蛋白质大约有1010-1012

18、种，不同的蛋白质具有不同的结构。那么，由20种氨基酸如何组成了数目繁多、结构各异的蛋白质大分子？,20世纪50年代初，Linder-Strop-Long及其同事最先认识到蛋白质具有不同的结构层次，并引入一级、二级、三级结构来描述这一现象。这是蛋白质分子在结构上的一个最显著的特征。,这种划分尽管有一定的缺点，但它反映了蛋白质分子结构的多层次和错综复杂的基本特点。这种划分概念清楚，使用也方便。60年代以后，随着对蛋白质分子结构知识的积累，又增加了不少新的内容。如在三级结构以上又增加了四级结构，在二级和三级结构之间又增加了超二级结构和结构域这两个结构层次。,一.蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构（p

19、rimary structure）：多肽链内氨基酸残基从N-末端到C-末端的排列顺序及二硫键的位置，也称氨基酸的序列、排列顺序，是蛋白质最基本的结构。,(一)肽键和肽链的结构,肽键(peptide bond)是蛋白质中氨基酸之间的主要连接方式，即一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基之间脱去一分子水相互连接（酰胺键）。参与形成肽键后，氨基酸即变为氨基酸残基。此外，侧链基团参与形成的酰胺键称为异肽键。,共价主链：由肽单位规则地重复排列而成。,(二)肽的命名及结构,最简单的肽由两个氨基酸通过一个肽键连接而成，称为二肽；依次称为三肽、四肽、五肽等。寡肽：少于10个氨基酸。多肽：多于 10个氨基酸。

20、蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000（也有说5000）道尔顿以上的多肽称为蛋白质。,肽的命名一般根据其功能和来源进行,如脑啡肽（enkephalin，EK），1975年，Hughes and kosterlitz发现猪脑内有内源性吗啡样活性物质，并从脑抽提液中分离纯化出两种脑啡肽，它们均由5个氨基酸组成。现已证明，高等动物脑中有两种形式的脑啡肽：蛋氨酸脑啡肽，H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH 亮氨酸脑啡肽，H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH,自然界中的肽有开链式结构和环状结构,环状肽找不到它的自由的氨基端和自由的羧基端。环状肽在微生物中常见。如短杆

21、菌肽S，对革兰氏阳性细菌有强大的抑制作用。a-鹅膏覃碱，是一个环状8肽，存在于毒蘑菇中，它能抑制真核RNA聚合酶的活性,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽)由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine,缩写为 Orn）。这些存在于自然界中的、具有特殊生理功能的（小）肽类，叫做生物活性肽。,(三)肽链表达式,甘丙丝撷亮蛋赖赖精谷Gly-Ala-Ser-Val-Leu-Met-Lys-Lys-Arg-GluG-A-S-V-L-M-K-K-R-E,(四)

22、蛋白质一级结构的测定（参考）,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger发表测定的胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目.多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,1）样品必需纯（97%以上）；2）知道蛋白质的分子量；3）知道蛋白质由几个亚基组成；4）测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。5）测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,（1）测定蛋白质的一级结构

23、的要求,（2）蛋白质一级结构的测定步骤：1.多肽链的拆分2.测定蛋白质分子中多肽链的数目3.二硫键的断裂4.测定每条多肽链的氨基酸组成5.分析多肽链的N-末端和C-末端。6.肽链断裂成多个肽段7.测定每个肽段的氨基酸顺序。8.确定肽段在多肽链中的次序9.确定原多肽链中二硫键的位置。,(1)多肽链的拆分由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,(2)测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系

24、，即可确定多肽链的数目。,(3)二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,作用：这些反应可用于巯基的保护。,巯基（-SH）的保护,(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；,(5)分析多肽链的N-末端和C-末端。,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨

25、基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,末端基氨基酸测定,二硝基氟苯（DNFB）法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,末端基氨基酸测定,丹磺酰氯法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,末端基氨基酸测定,肼

26、解法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,末端基氨基酸测定,氨肽酶法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根具不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；

27、B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,末端基氨基酸测定,羧肽酶法,(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,Trypsin：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。,肽链,水解位点,胰蛋白酶,或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。,肽链,水解位点,糜蛋白酶,Pepsin：R1=苯丙氨酸Phe,色氨

28、酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,thermolysin)：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,分别从肽链羧基端和氨基端水解,肽链,水解位点,羧肽酶和氨肽酶,化学法：(Cyanogen bromide)溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,Edman氨基酸顺序分析法,(8)确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用对角线纸电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,