遗传学ppt课件第6章离体繁殖.ppt

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1、第六章离体繁殖,第一节离体繁殖1、离体繁殖的概念与特点2、再生植株的途径3、基本程序 4、离体快繁中主要问题 5、商业化离体快繁参数的估计第二节无病毒苗的生产1、意义2、脱除病毒的原理与方法3、植物脱毒程序,第三节人工种子1、人工种子的概述2、繁殖体种类及其培养技术、人工种子制备,第一节离体繁殖,一、离体繁殖的概念与特点1、概念（In Vitro Propagation）：也称微型繁殖（Micropropagation）或快繁（Rapid Propagation）：通过无菌操作,分离植物体的一部分即外植体接种于培养基上,在人工控制的环境条件下进行培养,经过诱导、增殖和生根几个阶段，使其再生出完

2、整植株的一套技术与方法。,第一节离体繁殖,2、特点 与常规的繁殖相比：繁殖速度快。占用空间小。能周年安排生产。有利于无病毒苗的培育。便于种质保存和交换。有利于其他相关科学的研究。3、成就 1000多种植物的离体繁殖已获成功！园艺植物上，最早的是兰花，迄今，已建立了香蕉、柑桔、葡萄、苹果、草莓、猕猴桃、枇杷、罗汉果、马铃薯、西瓜、兰花、杜鹃、水仙、月季、百合、康乃馨、菊花、唐昌蒲、小苍兰、金线莲等数十种园艺植物离体繁殖技术程序。,第一节离体繁殖,外植体,体细胞胚,愈伤组织,再分化,再分化,完整植株,器官发生,二、再生植株的途径,脱分化,第一节离体繁殖,第一节离体繁殖,三、离体快繁基本程序,离体繁

3、殖的基础,离体繁殖的中心工作,完整植株的获得,材料准备及无菌培养,培养物的增殖,生根成苗,阶段,阶段,阶段,阶段,炼苗与移栽,成功的标志,第一节离体繁殖,阶段材料准备及无菌培养 外植体的选择和消毒、无菌操作技术及 适合的培养基配方使外植体脱分化,保证无菌（各环节都应相当严格）损伤小（能够存活较长时间，且不影响分化）操作技术过关（速度与技巧等）培养条件适合（利于材料的恢复与生长）,第一节离体繁殖,阶段培养物的增殖成功与否关系到所建立的无菌培养物系统能否应用于生产实际,外植体分化培养基上进行分化培养形成形成体胚或不定芽，称为增殖体 目的：对增殖体不断反复更新继代培养，获得所需数量的胚、芽或其它器官

4、。,第一节离体繁殖,继代培养：将培养物切分并转移到培养基成分不变的新鲜培养基上进行培 养。,目的：将增殖体扩大繁殖。,第一节离体繁殖,由于植物的种类和自然生长习性不同，其增殖方式及所采取相应技术措施也不一样。一般来讲，培养物的增殖有以下5种方式：1、腋芽增殖，2、不定芽（器官）增殖，3、胚状体增殖，4、愈伤组织增殖，5原球茎增殖。,1、腋芽增殖 基础：高等植物的每一叶腋中均存在腋芽，在适宜的条件下每一个叶腋均能长成一个新的枝条或小植株。在离体培养条件下，培养基中加入适量的分裂素（6-BA，6-KT，ZT或TDZ）或去除顶端不加任何激素，即可长出腋芽或芽丛，经过反复切割可得到大量的芽，再经过生根

5、培养就可获得大量的试管苗。特点：方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。适用作物：马铃薯，草莓、葡萄、月季等,腋芽增殖,第一节离体繁殖,2、不定芽增殖 在离体培养条件下，诱导不定芽需要同时加入外源的生长素和分裂素，二者的配比以分裂素略高于生长素，以避免产生过多的愈伤组织。分裂素中使用最多的为6-BA,TDZ（苯基噻二唑基脲），特别是TDZ对不定芽的诱导率最高。特点：繁殖系数高，有较好的遗传稳定性。Note:诱导不定芽的时，激素使用浓度不能过高，否则 易产生变异；另外，继代一定次数以后，当不定芽形成减弱时要重新建立无菌培养物。适用作物：紫 罗兰、兰花、香蕉、风信子等。,分离,第一节离体繁

6、殖,3、胚状体增殖目前，在组培条件下现已有30多个科、150多种植物可以产生胚状体；但对外植体的要求较高，在胚、分生组织或生殖器官作外植体时能获得较多胚状体。在胚状体成熟以后，要及时转移到低浓度或不含生长素的培养基中让胚状体成熟。特点：繁殖率高，胚的双极性使生根更容易。需要突破的技术关键：胚的不同步发育，成苗率低。植物的快速繁殖用的不多，在人工种子方面研究较多。,第一节离体繁殖,4、愈伤组织增殖 所有植物均可以通过组培诱导愈伤，再进一步分化即可获得完整植株。这一途径经历了组织培养技术的所有过程，如愈伤愈伤增殖芽分化根分化完整植株。特点：成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性差。对要求遗传稳定性高的

7、作物品种，不能采用这一途径；但在花卉中有比较大应用前景。,5原球茎增殖 原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。大部分兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。,orchid PLB,阶段 生根成苗目的是使繁殖体能成功移植到土壤中。生根是获得完整植株的一个关键。通过腋芽、不定芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生根才能移植。促使试管苗生根的方法通常有两种：一种是在固体培养基上诱导生根。当试管苗长到23厘米高时，将它从基部切下，转移到固体培养基上生根（生根培养基一般要求降低矿物营养的浓

8、度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定）；另一种是浸泡的方法，将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上或者扦插在人工基质上，十天左右即可生根。（瓶外生根）,第一节离体繁殖,第一节离体繁殖,MS+NAA2.5mg/l+BA0.5mg/l,MS+NAA2.5mg/l,MS无激素,MS+NAA0.5mg/l,MS+NAA1.0mg/l,1、试管苗的生长环境,无菌 弱光 恒温 高湿（100）,第一节离体繁殖,阶段 炼苗与移栽 试管苗要从一个无菌的、弱光照的、温度恒定的和湿度饱和的培养条件下移到一

9、个有菌、低湿、自然光和环境不稳定的土壤中，是一个变化剧烈的过程，稍不注意，就会大批死亡以致前功尽弃。,第一节离体繁殖,1）形态解剖方面（1）根弱小、无根毛（2）叶 叶的角质和蜡质层不发 达。无表皮毛，保水和反光能 力差。叶细胞结构疏松。叶气孔突出，张大。叶存在排水孔。,2、试管苗的特点（弱点）形态解剖和生理功能,2）生理功能方面 根的生理功能：低叶片表面极易散失水分气孔不能关闭叶光合能力较低。,3、克服试管苗弱点，提高其移栽成活率的措施 提高瓶苗的质量，提高抗逆性；创造组培苗适宜的炼苗环境 移栽时的注意事项。,第一节离体繁殖,无菌 弱光 恒温 高湿（100）异养,湿度降低 光照增强 温度升高

10、温差变大 杂菌增加,第一节离体繁殖,提高瓶苗的质量，提高抗逆性；,培养瓶生壮苗、理想的生根配方和生根环境的调控。加入生长控制剂，如多效唑，B9，CCC，其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。,创造适宜的炼苗环境 将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为1030D。,第一节离体繁殖,第一节离体繁殖,移栽时应注意的问题,A：防止菌类滋生 苗底部培养基要清洗干净 杀菌剂处理苗的根部 定时用杀菌剂处理种植基质常用杀菌剂：KMnO4,百菌清、多菌灵、托布津，使用浓度0.1,B：保持小苗水分供给充足,C：移栽时选择合理的种植基质 基质要疏松透气，有适宜的保

11、水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭。,第一节离体繁殖,泥炭 蛭石 椰糠,芦荟的植物组织培养过程,1 2 3 4 5,6 7 8 9,10 11,四、离体快繁中的三个重要问题污染、褐变、玻璃化。1、污染 1）细菌污染,第一节离体繁殖,表现症状：粘液状，混浊或发酵起泡；常伴有酸臭气味；接种后35天即可表现出来。,2）真菌污染,第一节离体繁殖,表现症状：发霉，颜色多样，灰、白、黄、绿色。症状表现较迟，多在接种7天后才表现出来。,第一节离体繁殖,3）造成污染的原因,空气；不完全的灭菌处理；人员和操作失误；超净工作台滤网。,2、褐变 1）褐变的现象：是植物离体培养中一

12、个比较普遍发生的问题，外植体接种后，于伤口处发生褐化，产生褐色物质。不仅使培养基变褐，而且很容易造成培养物死亡，或严重抑制外植体的脱分化和再分化。2）褐变的机制：酚类化合物与多酚氧化酶在有氧气存在的情况下，多酚氧化酶催化酚类物质氧化成褐色的醌类，醌类物质在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体细胞中的蛋白质聚合，生长停顿，最终导致死亡。另外，组织老化、细胞病变也会激活酚氧化酶而引起褐变，故在愈伤组织培养、细胞悬浮培养、原生质体培养中，也存在褐化现象。,第一节离体繁殖,第一节离体繁殖,（）植物类型；（）外植体的生理状态及发育年龄；（）培养基组份的影响；（）培养条件；（）每代的培养时间。,第一节离体繁殖,

13、三个选择：分生能力强的外植体合适的培养基（无机盐成分浓度、合适的蔗糖浓度和激素水平）环境条件（温度、光照）两个加入：活性碳抗氧化剂（PVP、Vc等）一个连续：连续将材料进行转移,对策,原因,3）影响褐变的因素和解决方法,2、玻璃化：当植物材料不断地进行离体培养时有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状、水渍状的现象，或是出现肿胀、失绿，叶片皱缩卷曲、脆弱易碎等情况，称为玻璃化。功能表现：表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；生根困难，移栽后也很难成活。,第一节离体繁殖,第一节离体繁殖,玻璃化苗,1）玻璃化产生的因素 琼脂和蔗糖

14、浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。许多学者证明培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越高，玻璃苗比率越大。Hakkart F.A.等认为玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的。密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一。培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素。不同的外植体，其玻璃化程度不一样，以留兰香基部节段所形成的试管苗玻璃苗严重，中部茎段次之，茎尖最好（柴明良）；重瓣丝石竹中部茎段出现玻璃苗较多，基部茎段较少，茎尖没有（郭达初）。郭东红等（1989）认为瑞香茎尖外植体大小与玻璃化相关，茎尖外植体越小，出现玻璃苗比率越大

15、。,第一节离体繁殖,2）防止和克服玻璃化的措施 两个“增加”：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量；两个“增强”：增强容器通风；增强光照（自然光照）；两个“加入”：加入渗透剂；加入ABA；一个“减少”：减少培养基氮含量,第一节离体繁殖,培养基中可利用水的含量过高，试管苗可吸收的水分太多，植物内具有过多的游离水引起。,五、商业性离体快繁需要估算的参数 试管育苗需要有一定的设备和厂房（投资较大），并要求具有成熟的技术条件，否则工作就无法开展。另外，市场因素至关重要，否则只会徒劳无功。1、市场因素 决定苗木的生产规模和效益 2、技术因素决定苗木的质量和成本 污染率，继代代期，增殖率和生根率，继代次数，变异率，

16、培养基配方，环境条件控制。3、其它因素：如劳动力，基础设施，投资规模等,第一节离体繁殖,第一节离体繁殖,降低生产成本的措施：自来水代替无离子水：培养效果良好，但要注意调好pH值。培养基中减掉有机成分：影响不大。培养基中减掉微量元素：短期培养无影响。食用白糖代替蔗糖：完全一样。自然光照代替人工光照：散射阳光下有的幼苗生长更好，但要考虑温度。,一、意义据报道，植物病毒已超过600种，严重危害着农业生产。如：草莓病毒的危害，曾使日本草莓严重减产，品质大大退化，使生产几乎受到灭顶之灾。柑桔的衰退病曾经毁灭了巴西的大部分柑桔。据统计，每年由于病毒病的危害，全世界的粮食损失为200亿美元。,第二节培育无病

17、毒苗木,防治方法：目前生产上还没有特效药可以彻底除去病毒。抗病毒育种（常规和基因工程）步履艰难。,目前受病毒为害严重的作物有：大田作物：马铃薯，烟草，甘蔗 蔬菜：白菜，大蒜，番茄，萝卜 果树：柑橘，苹果，草莓，香蕉 花卉：菊花，天竺葵，紫罗兰,第二节培育无病毒苗木,二、脱除病毒的原理与方法1、离体脱毒的基本原理 1934年，White通过观察烟草根系，首先发现病毒在根系内的不同区域分布是不均匀的，越靠根尖区病毒含量越低，在根尖分生组织区(生长点)的顶端不含病毒。1949年，Limasset和Cornuet根据White的发现提出，在芽的分生组织区也应存在与根尖分生组织同样的情况。1952年，M

18、orel和Martin首先利用茎尖分生组织培养获得了马铃薯无病毒苗，同时建立了茎尖脱毒的组织培养技术体系。病毒在植物体内的分布具有不均一性,第二节培育无病毒苗木,1889年，爪哇人就采用热水浸泡甘蔗种的方法来防治当时的病毒病。病毒和寄主对高温的忍耐性存在差异。,2、脱毒的方法 当前脱除植物病毒的方法主要有四种：-茎尖培养脱毒法；-热处理脱毒法；-微芽嫁接离体培养脱毒法；-珠心组织脱毒法；,第二节培育无病毒苗木,1）茎尖培养脱毒法茎尖脱毒效果好，后代遗传性稳定，是目前生产上最常用的脱毒措施。（1）茎尖培养脱除病毒的依据 病毒在植物体内的分布是不均一的（2）茎尖无病毒的假说 茎尖病毒复制的速度比植

19、物细胞分裂的速度慢 病毒侵入植物细胞后，其DNA随着细胞的分裂而复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争，在迅速分裂的植物细胞中，病毒的繁殖赶不上植物细胞的繁殖。生长点、分生组织细胞是活跃分裂的细胞。病毒在茎尖的传播受到抑制 植物病毒的传播是主要靠微管束，或通过胞间连丝传递给其他细胞，而分生组织没有微管束，而胞间连丝效率低，因此病毒的传递扩散也受到一定限制。,第二节培育无病毒苗木,胞间连丝的直径20-200nm；但其有效运输通道直径只有（胞间连丝允许通过物质的最大极限Size exclusion limit，SEL，仅为 0.8-1.0 nm）；病毒直径一般为10-80nm。,因此，

20、如果利用这一小段区域进行再生的话，就可以从患病毒病的植株上得到无病毒苗，从而实现“脱除病毒”。这一区域有多大，操作上应该取多大？理论上，应只取生长锥，不带叶原基。实际上，由于成活率的矛盾，一般切取生长锥带1-3个叶原基，大约大小，并且与植物种类、病毒种类和芽眼本身的大小等有关（最小0.1mm，最大达3.0mm）。,第二节培育无病毒苗木,2）热处理法原理：病毒和寄主对高温的忍耐能力有差异，在一定的高温下，病毒失活而寄主存活，或创造有利于植物快速生长和分裂，不利于病毒复制的条件。可分为干热和湿热两种形式。,湿热处理,热水处理,蒸气处理,多适用于一些木本植物的休眠芽，其处理时间和温度的控制要非常严格

21、，否则会影响芽的生命活性。,第二节培育无病毒苗木,干热处理生产实际中应用最多，处理温度一般在50以下，可根据植物的耐热性和病毒的失活温度进行调整。几种主要植物常用的处理方法：香石竹3840 条件下处理两个月可除去全部病毒；菊花3538 条件下处理60d可使病毒失活；马铃薯37 条件下处理1020d可除去卷叶病毒；热处理后要立即取新稍嫁接或扦插获得脱毒植株。,为了提高茎尖脱毒的效果，往往与热处理结合使用，如康乃馨用40高温处理6-8周，再切取1mm的茎尖培养，柑桔枝条先经49-50热处理45-50min，再进行茎尖培养，脱毒效果好。,第二节培育无病毒苗木,3）微芽嫁接离体培养脱毒法可以把极小的（

22、0.2mm）茎尖，作为接穗嫁接到实生苗砧木上（种子实生苗不带毒），然后连同砧木一起在培养基上培养。微体嫁接脱毒技术已经在柑桔、苹果上获得成功。4）珠心组织培养脱毒法有人认为病毒是通过微管组织传播的，而珠心组织与维管组织没有直接的联系，故可以通过珠心组织培养获得无病毒植株。通过该方法，已经在柑桔、葡萄上获得了成功。其他化学脱毒法、花器官培养脱毒等。,第二节培育无病毒苗木,总之，采用茎尖培养脱毒法，必须将植物种类、病毒种类、剥离茎尖的大小以及培养基营养组成四个方面统一起来考虑，才能收到理想的脱毒效果。,第二节培育无病毒苗木,三、植物脱毒的程序,材料的准备 脱毒处理、离体培养 无病毒植株的鉴定 无病

23、毒苗的保存,利用,1、材料的准备,1）选用生长健壮，遗传性一致的品种为材料。2）了解该植物体内具有的病毒种类及危害程度。,第二节培育无病毒苗木,2、脱毒处理或离体培养,确定适合的脱毒处理方法。如果采用茎尖培养脱毒，在获得芽或不定芽后有个生根的过程。不同植物种类其生根难易存在差异，如马铃薯、甘薯不用改变培养基就可以生根，而香蕉和大多数花卉则需转入专门的培养基上生根。大多数木本植物生根困难，则可采用微芽嫁接的方式。,3、无病毒植株的鉴定,1）指示植物鉴定法；2）抗血清鉴定法；3）PCR技术；4）电子显微镜检测法。,第二节培育无病毒苗木,4、脱毒苗的保存与繁殖,保存：隔离种植保存或离体保存 繁殖：得

24、到的脱毒试管苗可直接用于生产，如大多数花卉，草莓、马铃薯、香蕉等；而对于一些木本植物，由于试管中继代成本高，且移栽成活率低而以嫁接繁殖为主要的繁殖方式，则可以选择隔离条件好的区域建立脱毒母本园以供采集接穗。,一、人工种子概述1、人工种子概念 人工种子(artificial seeds)亦称体细胞种子。1978年Murashige在Reinert（1958）、Steward（1958）等人体细胞胚（Somatic Embryogenesis）研究的基础上发现，利用植物组织培养中体细胞所形成的胚状体可以获得人工种子。Kitto和Janick（1982）制成了胡萝卜胚状体的人工种子。早期的植物人工种

25、子（Plant artificial seeds）是:指将植物离体培养物中产生的胚状体，包裹在含有养分和保护功能的外皮中，在适宜的条件下能够发芽出苗的颗粒体。,第三节人工种子,符合以下3个条件：（1）具有良发育的体细胞胚，并能发育成正常完整的植株。（2）具有能提供种胚发育所需营养的人工胚乳。（3）具有能起保护作用的人工种皮。,第三节人工种子,2、人工种子研制的意义,、在无性繁殖植物中，建立一种高效快速的繁殖方法，它既 能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效 应；、可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种 子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意 义；、对于一些不能

26、正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非 整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大 繁殖应用；、与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械 化操作，同时还便于储藏和运输。、与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的 危险；,第三节人工种子,据报道，现在已有26个科，36个属的植物种类进行了人工种子的研究，其研究范围显示出两个显著的特点：1、重要经济作物和粮食作物的研究报道日益增加；2、以微器官作为繁殖的报道明显增加，其中包括微 芽、微枝、原球茎、鳞茎、块茎等.Kamada认为（1985）：用含有营养成分的胶囊包裹着一个能发

27、育成植株的培养物（包括胚状体、芽体、小鳞茎等），这一类都可以称为人工种子。1987年，Bapat等首次用桑树（Morus alba）腋芽制成人工种子，证实了Kamada 的观点。,第三节人工种子,顶芽（1987）、不定芽（1991），愈伤组织块（1992），小块茎（1997），相继制成了人工种子。一些植物在离体培养时能产生小球茎（荸荠）、块茎（马铃薯），它们在制作人工种子时不需种皮和胚乳包被。人工种子（广义）：任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。,第三节人工种子,马铃薯试管块茎人工种子,试管块茎人工种子田间种植,人工种子的结构,繁殖体,人工种皮,人工

28、胚乳,繁殖体：离体培养产生的胚状体、球茎、茎段、芽、块茎等。微鳞茎、微块茎、球茎等不需包被。,标准结构,第三节人工种子,人工种子分类,包被的程度,裸露的或休眠的繁殖体 如微鳞茎，微块茎等。,人工种皮包被的繁殖体 一些体细胞胚、原球茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可维持良好的发芽状态。,水凝胶包埋再包被人工种皮(即有人工种皮和人工胚乳包被)的繁殖体。,根据繁殖体的类型,体细胞胚人工种子,非体细胞胚人工种子,第三节人工种子,以体细胞胚为繁殖体的人工种子,第三节人工种子,以器官（芽、鳞茎、球茎等）为繁殖体的人工种子,第三节人工种子,二、繁殖体种类及其培养技术 1、不同繁殖体的比较,第三节人

29、工种子,体细胞胚 形成需要经过至少两个阶段：第一阶段，在含高生长素浓度的培养基中，诱导培养胚性细胞；第二阶段，在较低生长素或无生长素的培养基中形成体细胞胚。,第三节人工种子,微芽 发生一般只需一个培养程序，但有时为了增加繁殖体的数量，也需进行一定次数的继代。微型变态器官 块茎、块根以及鳞茎、球茎类的繁殖体产生可能需要经过不同的诱导程序。,不同繁殖体成苗所需时间及成株率,第三节人工种子,2、不同繁殖体的培养体细胞胚规模化生产,第二节人工种子,作为人工种子繁殖体的体细胞胚，其基本要求是要具有发育上的同步性，还必需满足如下标准特征：其一，形态正常，具有完整的胚结构；其二，与母体植物的基因型基本相同，

30、特别是在重要经济性状和农艺性状上没有变异；其三，具有较好的成熟性，能耐一定程度的脱水。其次，作为实用化的体细胞胚种子还必需满足一定的数量需求，规模化生产是其基本前提。,第三节人工种子,Choi等（2002）建立了人参体细胞胚大规模液体培养体系，每500ml容器可生产体细胞胚12,000个。在体细胞发育至子叶期早期，将其转入1/2MS无机盐附加9%蔗糖浓度的培养基中诱导进入休眠，获得了良好效果。其它一些植物如芹菜、苜宿等体细胞胚的批量化培养也取得类似结果。,微型变态器官繁殖体的培养,第三节人工种子,光照：能够形成变态器官的植物常常具有光照周期上的双重需要，光照强度亦是影响变态器官形成的重要因素之

31、一。温度：离体培养诱导变态器官形成时，必需充分考虑自然条件下该植物变态器官产生所需要的温度条件。培养基蔗糖浓度：现有研究资料显示，培养条件下的变态器官形成与培养基的蔗糖浓度有关，较高的蔗糖浓度对于一些植物的微型变态器官形成似乎是必要条件。激素：植物变态器官的形成常常发生在内源激素发生某种变化以后，外源激素的调控主要通过内源激素的变化而起作用，而不同培养条件下的内源激素水平又具有很大差异。,芽繁殖体的培养,第三节人工种子,大多数情况下，微芽、不定芽的培养往往直接从外植体上直接诱导形成，培养方式简单，且勿需高浓度的激素处理，因此所产生的繁殖体基本保持了原有植物的品种特性。根据植物类型不同，可选取不

32、同的外植体类型作为芽产生的来源，如非洲紫罗兰一般选用叶片为外植体，诱导不定芽作为微繁殖体；榆树类植物则可选根作为外植体产生微芽；石竹类花卉可以茎尖为外植体培养侧芽作为繁殖体。,三、人工种子的制备繁殖体预处理、繁殖体的包埋、人工种皮的装配,第三节人工种子,体细胞胚,后熟培养,脱水干燥,包埋,微型变态器官,除去表面及多余的水分,表面消毒,芽,筛选,包埋,筛选,筛选,包埋,ABA处理强迫休眠,无激素培养基,1、繁殖体预处理,第三节人工种子,2、繁殖体的包埋人工胚乳,包埋基质,胚乳介质,人工胚乳,包埋基质的要求：首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植

33、操作中的安全。其次，保水性，能吸水回涨。另外，成本低、工艺简单。,第三节人工种子,包埋基质通常使用海藻酸钠，以 CaCl2 作络合剂进行固化。但也存在着保水性差、水溶性成分易渗漏、易失水、干燥到一定程度后不易吸水回涨等缺点。用某些纤维素衍生物与海藻酸钠复合改性的包埋基质（如海藻酸钠聚氮基葡萄糖等），既保留了海藻酸钠基质的特点，又具有良好透气性、保水性和吸水回涨性能等优点。,第二节人工种子,胚乳介质的选择原则是有利于人工种子的发芽、转株及贮藏。至少应包含繁殖体萌发时所需的养分和生长调节剂，此外，还应有防腐剂和防老剂等。在大多数的研究中，一般参考该植物组织培养时所使用的培养基和激素配制胚乳介质。此

34、外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。,胚乳介质,MS（或SH、White）培养基加入1.5%的马铃薯淀粉水解物；SH（0.5）培养基加入1.5%的麦芽糖。,以海藻酸钠作包埋剂的操作程序是：在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀。将其逐滴滴入2.0%-2.5%的CaCl2溶液中，经2030min.的离子交换作用即形成含有繁殖体具有一定刚性的人工种子，用无菌水漂洗20min.以终止反应。,图5.5 多头自动人工种子包被系统示意图。1.双活塞泵；2.灭菌器；3.加湿器；4.振动器；5.脉动腔膜；6.同轴沟；7.脉动腔；8.喷碟；9.旁

35、路系统；10.反应池；11.搅拌子；12.硬化溶液及其输入。（引自Brandenberger和Widmer，1998）。,第三节人工种子,第三节人工种子,实验室人工种子制作,第三节人工种子,3、人工种皮的装配,理想的人工种皮应该是：具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失，同时又具有良好的透气性、透水性。具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作。无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。配制简单易行，成本低。,常用的人工种皮材料,早期使用Elvax 4260涂膜，价格昂贵，操作复杂、包裹效果不尽人意。新近试验使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的Tullanox和微亲水的Cab

36、-O-Sil，二者均可以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作时只需将胶囊在上述材料中滚动即可完成包被过程，操作简单易行，大量生产还可以机械化操作。最近还报道一种硅酮种衣，它不仅可以抗真菌，而且可渗入水蒸气和氧气，这些材料均还处于试验之中。,第三节人工种子,用至今所报道的包埋方法得到的人工种子，仍存在表面发粘、强度小、不利于运输及播种、营养渗漏快、保水能力差、易受土壤环境的影响等问题。,第三节人工种子,人工种子制作程序,体细胞胚,外植体,贮藏、播种,人工种子,微芽,微型变态器官,繁殖体的包埋（人工胚乳）,人工种皮的装配,第三节人工种子,a.番木瓜体细胞胚人工种子（Castillo等，1998）；b.马铃薯微芽人工种子（Patel等，2000）；c.人参体细胞种子（Choi和Jeong，2002）。,第三节人工种子,