细胞总RNA提取及逆转录.ppt

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1、分子生物学实验,1、每组同学做一份实验；2、遵守实验室规则，穿白衣；3、同学们在听课时要作好记录;4、上课时间。,欢迎大家参加分生实验课的学习！,1.实验成绩考核占总成绩15%。2.每次实验报告5分含随堂测试，共三次，合15分。3.缺实验课成绩者，本课程不予通过。【每名同学的3个实验报告放在一起，最后一次实验课交。学生交卷后签名。教师按学号排卷。】,2013年 五年制 实验课考试形式,1.加样器2.离心机,先介绍本轮实验中两种常用仪器的使用方法,3、根据取样量，选择合适量程的加样器。,顶部标记加样器的最大量程，分别为：20 l:0.5 20 l100 l:20 100 l 1000 l:200

2、 1000 l,一、加样器的使用及注意事项,1、用途 微量吸取液体 2、每组3支加样器,Q：如果要吸取5l、50l、150l、500l的液体，应选择哪个加样器?,练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少?,4、如何调节？,(1)首先观察目前的读数,假设为050:最大量程为20l的加样器 5l 最大量程为100l的加样器 50l 最大量程为1000l的加样器 500l(2)顺时针调节-读数变小 逆时针调节-读数变大(3)注意：调节前，加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。,5、加样器使用步骤：1）选择加样器,观察读数,调节读数。安装吸

3、头要紧密(不要用手直接拿吸头)，安装后旋转固定一下。2）在液面外，先按到第一挡。3）将吸头插入液面下的适当深度:过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。4）缓慢松开拇指,吸取液体。完全放开拇指后，停留半秒钟。急于离开液面，易吸入空气。5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去6）贴容器内壁，加样器推到第二挡将液体匀速打出。(吸头内有液体时，不能将加样器平放或倒置，液体会倒流损坏加样器！)7)观察吸头内液体是否完全打出，将吸头弃于废物盒内。,第一挡为实际读数体积，第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。,1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐

4、蚀。,1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。,3、将样品标记好并配平,对称放入离心机（管的连接处朝外）。4、设定离心的转速和时间。5、统一离心。,Team Work,二、离心机的使用及注意事项,实验一、细胞总RNA的提取及逆转录,实验内容：1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳 3、以总RNA为模板的逆转录反应,一、真核细胞的总RNA 1、mRNA:1-5%5鸟嘌呤7位甲基化CH3修饰。1）免受核酸酶破坏，2）起始、促进蛋白质合成。3poly(A)尾巴结构 20-200个A.翻译所必需。起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。2、tRNA:10-15%3

5、、rRNA:80-85%大亚基60S:28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S:18S=1874nt,第一步：提取小鼠肝脏组织的RNA,二、RNA提取的注意事项,RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性RNase 污染 A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C.一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。D.玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase 活性：RNase 抑制剂。,RNA分离的关

6、键因素：避免RNA酶的污染。,1)发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。将1mL Trizol试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mL的Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。4)室温孵育10 min。,三、RNA提取的实验操作,1、异硫氰酸胍法：GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 RNase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。特点：需低温

7、操作，但价格经济。2、Trizol 试剂（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总RNA，简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。,课间介绍 RNA提取的几种方法,RNase抑制剂介绍,1、DEPC(二乙基焦炭酸盐)最常用的RNase抑制剂:与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。有效浓度：0.05%-0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。用于浸泡各种器材。灭活条件：高压。在Tris溶液中半衰期为1.25min。试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制,高压)

8、储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C，或液氮中。2、肝素：使用浓度：0.110mg/ml 效 果:37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。如果与DEPC联合应用，具有极强的抑制 效果。,5)加入200 l氯仿，震荡混匀20-30s，室温放置5min（此期间液体开始分层，此时不要轻易搅动液体）。)10000 rpm，离心5min。,7)将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。,三、RNA提取的实验操作,8)沉淀RNA：加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。10000rpm，离心10min。弃上清。)加1ml 75%乙醇洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动

9、沉淀)10)7500rpm离心1min，弃上清。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。,用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。,12)室温干燥35min。（干燥的时间由RNA沉淀大小决定）（干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）,注意事项：,RNA:避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。,RNA pelle

10、t：透明胶样干燥后应该无色透明,13）RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5l，加到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。14)吸出 4.5 l溶液放到冰上备用(将用于电泳)。15)剩余 9 l溶液放到冰上备用（将用于RTPCR）。,注意：RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。,避免气泡的方法：用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体,判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯为止。,逆转录酶：存在于逆转录病毒体内。常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC。以mRNA为模板的DNA聚合

11、酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。,第二步：逆转录反应,mRNA,3-TTTTTT(18)-5,68-70oC,annealing,3-TTTTTT(18)-5,37-42oC,RTase,mRNA,mRNA,cDNA,10min,1-2h,RT,第一步：打开RNA链之间的二级结构，使Oligo dT 特异性地结合到 PolyA 尾。总RNA 9 l Oligo dT(0.05g/ml)1 l(终浓度：2.5 ng/ml)轻弹管底混合，置65水浴10min，然后立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。,

12、在水浴10分钟时，开始RNA电泳。,按照下列方法进行RT反应：,RNA的变性（甲醛变性法）：打开RNA分子二级结构，其分子量和电泳距离相关。5甲醛变性缓冲液 2 l 甲酰胺 10 l 37%甲醛 2 l RNA样品 4.5 l 上样缓冲液 3 l 混匀后，21.5 l 直接电泳上样（100伏，1030分钟）上样前可先预电泳5min。,注意:电泳槽的清洁！所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。琼脂糖凝胶要新鲜配制！紫外透射仪观察电泳结果,第三步：RNA 的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂：5RT-buffer 4 l RNasin(40U/ml)1 l dNTP

13、s(10mmol/L)4 l AMV 1 l 轻弹管底混合，置42水浴1h。将上述反应移至68水浴10min（灭活RTase），并冰浴，保存备用。,混匀后，可用离心机甩一下,基本过程同DNA电泳一样，但：1.必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；2.因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行变性电泳以打开其空间结构，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。,RNA电泳,RNA电泳结果,rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取

14、mRNA是否存在降解。RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。,分析本次实验结果：28S、18S和5S的比例。,RNA电泳结果分析,RT引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。,关键点：RNA是否充分溶解根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用1ml Trizol试剂提取出来的总RNA适合于20l体积的逆转录反应体系。引物的量是否合适高温退火避免Oligo dT锚锭点错误，同时，打开RNA链之间的二级结构，利于RT。退火后一定迅速放在冰上,实验报告思考题：,提取细胞内RNA时，如何防止RNA酶的污染？如何分析RNA变性电泳的结果，可以据此准确判断RNA是否降解吗？为什么？,实验结束后：整理实验台；交实验报告；值日生值日。,Thanks everyone,