生物化学实验-层析实验.ppt

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1、实验项目：氨基酸（单向）纸层析,层析技术的基本知识材料与方法结果与分析实验报告及课外作业,层析的概念：1903年俄国植物学家Tswett发现植物叶子中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成色谱，故称这种混合物分离的方法为色谱法（chromatography），又称色层分析法或层析法，随后被广泛用于无色物质的分离与层析。近半个多世纪以来，层析技术发展很快，由于这一技术具有分离效率高、应用范围广、分析速度快、样品用量少、易于自动化及能够与其他方法配合使用等优点，因此层析法近年来在各类分析化学方法中有十分重要的地位，已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科的重要研究手段。实验目的：使学生掌握层析

2、的概念、层析技术的原理、层析技术的发展状况以及层析技术的应用范围，同时使学生掌握纸层析技术的基本操作规程。,1 层析技术的基本知识,1.1 层析的概念层析即色层分析也称色谱（chromatography），是分离物质、鉴定物质（定性或定量）常用的生物化学技术，它是由两个相组成的系统，一个为固定相或静相（stationary phase），一个为流动相或动相（mobile phase）。混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数（partion或distribution coefficient）来描述。,1.2 层析的基本原理 层析法各种各样，但基本原理是一

3、致的。它是利用混合物中各组分理化性质（分子形状和大小、带电状态、溶解度、吸附能力、分配系数、分子极性以及分子的亲和力等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定的（称为固定相），另一相则流过此固定相（称为流动相），造成流动相对固定相作单相相对运动，流动相推动样品中各组分经固定相向前迁移，使各组分迁移速度不同，而对物质进行分离的方法。固定相可以是固体、液体或一种固体和一种液体的混合物，而流动相可以是一种液体或一种气体。,层析方法有许多种，根据两相的状态和分离依据的原理的不同进行分类如下表。,1.3 常用的层析技术种类,1.3.1 柱层析层析柱中的填充物或称支持物都是一些具有亲水性的

4、不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。支持剂吸附着一层不会流动的结合水，可以看作固定相，沿固定相流过的与它不互溶的溶剂（如苯酚、正丁醇等）是流动相。由填充料构成的柱床可以设想为由无数的连续板层构成，每一板层都起着微观的“分溶管”作用。当用洗脱剂洗脱时，即流动相移动时，加在柱上端的氨基酸混合物样品在两相之间将发生连续分配，混合物中具有不同分配系数的各种成分沿柱以不同的速度向下移动，分部收集柱下端的洗脱液。收集的组分分别用茚三酮显色定量。,图1-1 柱层析示意图,1.3.2 薄层层析图1-2 薄层层析装置。薄层层析分辨率高，所需样品微量，层析速度快，可使用的支持剂种类多。如纤维素粉、硅胶和氧化铝粉等，

5、因此应用比较广泛。薄层层析的大体步骤如下：把支持剂涂布在玻璃板上使成一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层（如图1-2），使样品中各个成分分离开来，最后进行鉴定和定量测定。,图1-2 薄层层析装置,1.3.3 高效液相层析高效液相层析（high performance liquid chromatography，简称HPLC）曾称高压液相层析，是近二十多年内发展起来的一项快速、灵敏、高效的分离技术。HPLC的特点是：使用的固定相支持剂颗粒很细，因而比表面积很大；溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。多种类型的柱层析都可用HPLC来替代。高效液相的图

6、解见下图。,图1-3 高效液相层析的图解,1.3.4 离子交换层析离子交换柱层析（ion-exchange column chromatography）是一种用离子交换树脂作支持剂的层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）等不溶性高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质（matrix），带电基团是通过后来的化学反应引入基质的。树脂一般都制成球形的颗粒。,分离氨基酸混合物经常使用强酸型阳离子交换树脂。在交换柱中，树脂先

7、用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（pH23）上柱。在pH23时氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而被“挂”在树脂上。氨基酸在树脂上结合的牢固程度即氨基酸与树脂间的亲和力，主要取决于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用。在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是碱性氨基酸（A2+）中性氨基酸（A+）酸性氨基酸（A0）。为了使氨基酸从树脂上洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，有效的方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度（离子强度），这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。目前已有全部自动化的氨基酸分析仪（amino acid an

8、alyzer）（如图1-4）,1.3.5 气液层析当层析系统的流动相为气体如氢、氦、氮，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体时，此层析系统称为气液层析或气液色谱（gas-liquid chromatography），简称气相层析或气相色谱。利用气相层析法进行分离也是基于分配过程，即利用样品组分在流动的气相和固定在颗粒表面的液相中的分配系数不同达到分离组分的目的。涂有薄层液体的惰性颗粒（固定相）被装在一根长的不锈钢管或玻璃管中，称层析柱，保持在适当的温度下，令高压的气体（流动相）连续地通过层析柱。待分离的样品注入进样室后经气化导入气相，流经固定相。此时，气化的样品将在流动的气相和固定的液相之间发生分

9、配，把组分分离开来。（如图1-5）气相层析法具有微量快速的优点。它在分析生物成分方面的一个限制是要求样品能气化和热稳定性高。氨基酸由于含有各种极性基团，气化十分困难，必须把它转变成容易挥发的化合物才能进行气相层析。,图1-5 气相层析仪的基本组件,1.3.6 分配层析分配层析是测定蛋白质中的氨基酸组分的一种常用的方法，此方法简单易行，操作方便，结果明显。本次实验分离氨基酸就是用的这种方法，以下着重介绍这种方法。,1.4 分配层析的原理,分配层析是利用混合物中各组分在两种或两种以上不同溶剂中的分配系数不同而将混合物中各组分彼此分离开来的方法。当把一种物质在两种互不相溶的溶剂系统中振荡时，它将在两

10、相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种中的浓度之比是一个常数，此常数称为分配系数（KD）。分配层析法实际上是一种连续抽提法。在它的溶剂系统中，一种溶剂通常是水和被有机溶剂所饱和的水溶液，吸附在惰性固体载体上，构成固定相。载体在分配层析中只起负载固定相的作用，它们是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质，如淀粉、纤维素粉、滤纸等。固定相除水外，也可用稀硫酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液。另一种溶剂是被水饱和的某种有机溶剂，构成流动相。流动相一般采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。,现在我们举逆流分溶或逆流分配（countercurrent distribtion）的方法作为分配层析原理的说明。此方

11、法的基本原理如图1-6示。取一系列管（称为分溶管），向第1号管加入互不相溶的两种溶剂，A为上相，B为下相。然后加入物质Y（KD=1）和物质Z（KD=3）的混合物（假设总量各为64份），各组分物质按其自身特有的分配系数在上下相中进行分配。达平衡后，将上相转移到第2号管内，其中含有相同体积的新下相。从第1号管转移来的样品将在第2号管的上下相中再分配。与此同时，向第1号管内加入新的上相，这里也将发生样品的再分配。这样完成了第1次转移。转移n次后，某一物质在（n+1）个管中分布的分数含量是（p+q）n=1展开式相应项的值。这里，p和q分别为某一物质在上相和下相中的组分含量，即p+q=1。,图1-6 逆

12、流分溶原理,由图1-7的分溶曲线可以看出，分配系数大的物质Z（KD=3）沿一系列分溶管的“移动”速度，要比分配系数小的物质Y（KD=1）快。从分溶曲线还可以看出，每一种物质在一系列分溶管中是相当集中的，分溶曲线呈峰形，因此只要使用足够数目的分溶管，继续进行分配，就可以使两个峰彼此完全分开。一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时，转移次数越多，即分溶管树越多，其分溶曲线的峰形越窄而高，这样有利于混合物中各物质的完全分离。,图1-7 分流曲线,图1-8 纸层析中的Rf值纸层析是应用最广泛的一种分配层析，以滤纸为载体，滤纸上吸附着的水（约含水20%22%）是经常使用的固定相。某些有机溶剂如醇、酚

13、等为常用的流动相。层析时，滤纸一端浸入展层溶剂，有机溶剂连续通过点有样品的原点处，溶质中各种物质依据本身的分配系数在两相间进行分配。分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点进入无溶质区，并进行重新分配，不断向前移动。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配。由于各种物质的分配系数不同，随展层溶剂移动的速率也不同，从而达到分离的目的。物质在纸上的移动速度可以用Rf值表示（如图1-8）。某一物质在一定溶剂系统中的分配系数是一定的，因而移动速率（Rf值）也基本恒定，因而可根据Rf值来鉴定被分离的物质。,图1-8 纸层析中的Rf值,影响Rf值的主要因素是物质的极性和层析溶剂的选择。在

14、纸层析溶剂系统中，极性物质易进入固定相，非极性物质易进入流动相。所以Rf值主要由物质极性的大小所决定。极性大的物质其Rf值较小。另外，pH、温度、滤纸质地及展开方式也会影响Rf值。纸层析也是分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。将氨基酸混合物点在滤纸的一角上，然后在密闭的容器中用一个溶剂系统（如丁醇-乙酸）沿滤纸的一个方向进行展层。烘干滤纸后，旋转90，再用另一个溶剂系统（如苯酚-甲酚-水）进行第二相展层。由于各氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的Rf值，因此就彼此分开，分布在滤纸的不同区域。当用茚三酮溶液显色时，得到一个双向纸层析谱（如图1-9）。如果混

15、合物中所含的氨基酸种类较少，并且其Rf值彼此相差较大，则在一个溶剂系统中进行单向层析即可。,图1-9 氨基酸的双向纸层析图谱,2.1 实验材料2.1.1 仪器 层析缸或玻璃钟罩和平板玻璃（20cm20cm）；层析滤纸和普通滤纸；电吹风机；烘箱；喷雾器；毛细管、培养、皿镊子。2.1.2 试剂 氨基酸标准液（2mg/mL）：称取亮氨酸（Lue）、谷氨酸（Glu）、缬氨酸（Val）、脯氨酸（Pro）各1mg，分别溶于0.5mL0.01mol/L的HCl溶液中，保存于冰箱中。氨基酸混合液（2mg/mL）：称取上述氨基酸各1mg溶于0.5mL0.01mol/L的HCl溶液中，保存于冰箱中。展层剂：水饱和

16、酚溶液。显色剂：0.3%茚三酮丙酮溶液，避光保存。,2 材料与方法,2.2 实验方法 2.2.1 层析滤纸的准备取一张层析滤纸放在普通滤纸上，手拿滤纸两边缘。用铅笔在层析滤纸上距离一端1.5厘米处画线，并标记出点样位置。点样点之间一定要均匀分布。2.2.2 点样用毛细管平口端蘸取少量样品溶液，点样于滤纸的相应位置。要求样品斑点直径不超过0.3cm，待斑点样品干燥后，再点样，重复3次，以保证样品的质量。注意，在点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能到达的部分）。2.2.3 展层将滤纸插如竹签中，穿好后各个散开，然后将点样端朝下浸入展层剂，垂直放入，下沿水平接触液面，勿使样点浸入

17、溶剂，进行展层。当展层剂到达上界面线时，取出滤纸，用电热吹风机吹干滤纸上的溶剂。2.2.4 显色 用喷雾器把茚三酮溶液均匀细致地喷洒在滤纸有效面上，切勿喷的过多致使斑点扩散。然后用电吹风机吹干，即得到层析图谱。氨基酸于茚三酮反应呈现紫红色斑点，只有脯氨酸反应后呈黄色。,2.3 操作中应注意的事项点样量要适当，点样要均匀；尽可能不要用手去触摸滤纸；根据层析系统的具体情况，纸在层析缸的时间要尽可能的延长，以便时得分配系数相近的氨基酸分得开；喷茚三酮时要均匀、适量，不可过多，特别提醒学生不同喷到皮肤上，以免造成不必要的伤害。,3 结果与分析将滤纸放入层析缸1小时左右，取出滤纸，均匀喷茚三酮于滤纸上，

18、然后用带有热风的电吹风机吹干滤纸表面，此刻就出现了氨基酸与茚三酮的颜色反应，观察样品中的色带数，与标准氨基酸对照比较，确定样品中所含有的氨基酸种类。同时，向学生解释可能出现的实验结果及其原因。,4.1 实验报告要独立完成实验报告，实验报告要书写认真。实验报告尽可能按照科技论文的格式去写，要重点突出实验结果，并对实验结果作适当的分析；对实验中存在的问题可以在分析部分中进行讨论。4.2 课外作业复习层析技术的概念、原理及常用的层析技术种类；掌握分配层析的原理，氨基酸与茚三酮发生反应的条件和显现的颜色类型；Rf值的概念、如何计算Rf值以及影响该值的各种因素。参 考 文 献1 王镜岩，朱圣庚，徐长法，主编.生物化学，高等教育出版社（北京），2002.2 王宪泽，主编.生物化学实验技术原理和方法，中国农业出版社（北京），2002.,4 实验报告及课外作业,