生物制药工艺技术基础.ppt

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1、第二章 生物制药工艺技术基础第一节 生化制药工艺技术基础 由人体组织来源的生化药物具有疗效好，几乎无副作用的独特优点。但由于以人体组织提供的原料受到法律或伦理方面的严格限制，因此有许多人源性的生化药物已更多地采用生物工程技术生产。目前已生产应用的制品主要有血液制品类、人胎盘制品类和人尿制品类。动物来源的生化药物是天然生化药物的主要品种，它具有原料来源丰富、价格低廉，便于综合利用和批量生产的优点。,但由于提供原料的动物种族差异较大，所以对原料的品质和制品的质控要比一般药物更为严格。植物来源的生化药物品种正逐年增加，如酶、蛋白质 多糖和核酸等。海洋生物来源的生化药物是发展最快的一大类生化药物。海洋

2、生物种类繁多，是丰富的药物资源宝库，具有很大发展潜力。,一、生物材料与生化活性物质（一）生化制药的生物材料来源 供生产生化药物的生物资源主要有动物、植物、海洋生物和微生物的组织、器官、细胞与代谢产物。应用动、植物细胞培养与微生物发酵技术也是获得生化制药原料的重要途径。基因工程技术与细胞工程技术和酶工程技术更是开发生化制药资源的新途径。,1、动物脏器 以动物组织器官为原料可以综合利用制备100多种生化药品。动物组织器官的主要来源是猪，其次是牛、羊、家禽和鱼类等的脏器。l）胰脏 胰脏是动物体内不可替代的实质性腺体之一。它兼有其他器官所没有的内分泌和外分泌两种功能。2）脑 脑组织富含脂质。脑组织中脂

3、类占13.5，蛋白质占810，还有少量黏多糖 脑组织中的主要脂类物质是脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、脑苷脂、神经节苷脂和胆固醇。还有神经递质和多种神经肽。,（3）胃黏膜 胃是动物的消化器官，主要分泌消化液、胃黏膜。（4）肝脏 肝脏是机体内最大的不可替代的实质性腺体，是机体的“生化反应器”。肝脏含有复杂的酶系，已知肝脏酶达数百种，有些是其他组织所没有或者含量极少的。如鸟氨酸氨基甲酰转移酶仅存在于肝细胞的微粒体中。肝脏还含有不饱和脂肪酸、磷脂类和胆固醇。肝脏富有肝糖原及维生素A、D、E、B12等。,（5）脾脏 脾脏是体内最大的免疫器官，已用于生产的药物有脾水解物，脾RNA和脾转移因子。人脾混合淋巴因

4、子制剂对原发性肝癌具有良好疗效。（6）小肠 小肠是消化和吸收的主要场所，含有丰富的淋巴组织和多种内分泌细胞。（7）脑垂体 脑垂体是重要的内分泌腺体，由两部分组成：脑垂体（前叶）包括远侧部、结节及中间部；神经垂体（后叶）包括神经部及漏斗部。垂体激素品种不少于10种。（8）心脏 心脏含有丰富的糖原、激素和酶类。,其他动物脏器如肺、肾、胸腺、肾上腺、扁桃体、甲状腺、睾丸、胎盘、羊精囊、气管软骨、眼球、鸡冠等也都是重要的生物制药原料。2、血液、分泌物和其他代谢物 血液约占体重的610，血液中水分占80，干物质占20。血液资源丰富，可用于生产药品、生化试剂、营养食品、医用化妆品及饲料添加剂等。尿液、胆汁

5、、蛇毒、蜂毒等也是重要的生物材料。,3、海洋生物 海洋生物是开发防治常见病、多发病和疑难病药物的重要生物材料。主要有：（1）海藻 海藻是海洋水生植物类，分绿藻门、褐藻门、蓝藻门、红藻门、甲藻门等10门，共10000多种。（2）腔肠动物 腔肠动物是原始多细胞动物，有9000多种。（3）节肢动物 节肢动物门中的某些甲壳动物可供药用。甲壳动物有25 000多种。,（4）软体动物 软体动物有80 000种，包括螺、蚌类和乌贼等。（5）棘皮动物 棘皮动物有6000多种，包括海星、海胆、海参。（6）鱼类 鱼类有20000多种，可制造多种药物。（7）爬行动物 爬行动物多数为陆生脊椎动物。海生的主要有海蛇、海

6、龟等。（8）海洋哺乳动物 用鲸鱼和海豚类的脏器和腺体已制成多种药物。其他海洋生物还有环节、海绵、扁形、纽形、两栖等也都是重要生物材料。,4、植物 药用植物品种繁多，除含有生物碱、强心苷、黄酮、皂苷、挥发油、树脂、鞣质等有效药理成分外，还含有氨基酸，蛋白质、酶、激素、糖类、脂类、维生素类等众多生化成分。由植物材料寻找有效生物药物已逐渐引起重视，品种逐年增加，以及各种蛋白酶抑制剂。,5、微生物 微生物资源非常丰富，已研究的品种仅占自然界中微生物总数的10左右。微生物的代谢物有1300多种，已大量生产的才近百种。微生物酶有几千种，已被应用的才几十种，可见其应用前景很大。（1）细菌 常用细菌发酵法生产

7、。主要发展领域有：氨基酸。有机酸。糖类。,核苷酸类。维生素。用细菌可制取多种维生素如VB1、YB2、VB6、烟酸、生物素等。酶。（2）放线菌 放线菌是最重要的抗生素产生菌，己有的1000多种抗生素约23产自放线菌。其代谢产物也是重要的生物制药资源。氨基酸。核苷酸类。,维生素。利用放线菌可产生维生素B12、B族维生素、胡萝卜素、蕃茄素及食品染料。酶。放线菌能产生众多品种的酶。（3）真菌酶有机酸。氨基酸。核酸及其有关物质。维生素。促生素。多糖。,（4）酵母菌维生素。蛋白质与多肽。核酸。6、开发生物新资源（1）动植物细胞的大规模培养 利用动植物细胞大规模培养产生生物药品是细胞工程技术的一大应用领域。

8、（2）应用基因重组技术建立“工程菌”或“工程细胞”，使所需要的基因在宿主细胞内表达，制造各种生物活性物质，是生物制药工业的重要发展领域。,（二）生物材料的准备1、生物材料的选择 生化药物生产原料的选择原则是：有效成分含量高，原料新鲜、无污染；来源丰富、易得；原料产地较近，价格低廉；原料中杂质含量少，便于分离纯化等。（1）有效成分的含量 生物品种 根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。,合适的组织器官。另外动物的年龄、性别、营养状况、产地、季节对活性物质的含量也有影响。植物原料要注意采集地点、季节，微生物原料要注意其对数生长期时间与活性成分的关系。（2）杂质情况 选材时，应避

9、免与目的物性质相似的杂质对纯化过程的干扰。（3）来源 应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。,2、生物材料的采集、预处理与保存 生物材料采集时必须保证环境卫生符合要求，并尽力保持原材料的新鲜，防止腐败、变质与微生物污染。生物材料采摘选取后，必须快速及时速冻，低温保存，防止生物活性成分的变性、失活，酶原提取要及时进行，防止酶原激活转变为酶。植物原料采集后可就地去除不用的部分，将有用部分保鲜处理。收集微生物原料时，要及时将菌体细胞与培养液分开，根据有效成分存在部位及时进行保鲜处理。,生物材料的保存方法主要有：冷冻法。本法适用于所有生物材料。一般先速冻后置于40处低

10、温保存。有机溶剂脱水法，常用的有机溶剂是丙酮。防腐剂保鲜法。常用乙醇、苯酚等。二、生化活性物质的提取（）生化活性物质常用的提取方法1、酸、碱、盐水溶液提取法,2、表面活性剂提取法与反胶束提取法 表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于水油界面时有分散、乳化和增溶作用。生物提取常用的表面活性剂，其HLB多在1020之间。在适当pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。,反胶束也称为反胶团。反胶束是表面活性剂分散于连续的有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束系统作为液液萃取方法，更具选择性。此法的优点是使热敏感性的，亲水蛋白质在一种近似水相的环境中

11、被提取出来，最大限度地保持了蛋白质的生物活性，蛋白质通过中间反胶束从一个主体相中转移到另一个水相中，并在瞬间完成。,3、有机溶剂提取 用有机溶剂提取生化物质可分为固液提取和液液提取（萃取）二类。（1）固液提取 在生物制药中常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂以及乙醚、三氯甲烷、苯等非极性溶剂。极性溶剂既有亲水基团又有疏水基团，从广义上说，也是一种表面活性剂。甲醇、乙醇、丙酮能同水混溶，同时又有较强的亲脂性，对某些蛋白质、类脂起增溶作用，乙醚、三氯甲烷、苯是脂质化合物的良好溶剂。,在选用有机溶剂时一般采用“相似相溶”的原则。丁醇在水溶液中解离脂蛋白的能力更强。在生化物质提取前，有时还

12、用丙酮处理原材料，制成“丙酮粉”，其作用是使材料脱水，脱脂，使细胞结构松散，增加了某些物质的稳定性，便于贮存和运输。有机溶剂既能抑制微生物的生长和某些酶的作用，也能阻止大量无关蛋白质的溶出，有利于进一步纯化。,（2）液液萃取 液液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响液液萃取的因素主要有目的物在两相的分配比（分配系数）和有机溶剂的用量等。,溶剂萃取的注意事项：（1）pH 在萃取操作中正确选择pH很重要。所以，酸性物质在酸性条件下萃取，碱性物质在碱性条件下萃取，对氨基酸等两性电解质，则采用pH在等电点时进行提取较好。（2）盐析 加入中性盐

13、如硫酸铵、氯化钠等可以使一些生化物质溶解度减少，这种现象称作盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率：盐析作用也能减少有机溶剂在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。,（3）温度 一般在室温或低温下进行萃取操作。（4）乳化 液液萃取时，常发生乳化作用。去乳化的常用方法有：过滤与离心；轻轻搅动；改变两相的比例；加热；加电解质；加吸附剂（如碳酸钙）等。液液萃取时溶剂的选择要注意以下几点：（1）选用的溶剂必须具有较高选择性。（2）选用的溶剂，溶质与溶剂要容易分离与回收。,（3）两种溶剂的密度相差不大时，易形成乳化，选溶剂时应注意。（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易得的溶

14、剂。4、双水相萃取法 双水相系统是两种亲水性的聚合物都加在一个水溶液中，当超过某一浓度时，就会产生两相，两种聚合物分别溶于互不相溶的两相中。其操作是向水相中加入溶于水的高分子化合物，如聚乙二醇（PEG）或葡聚糖，可以形成密度不同的两相（有时甚至是多相），因两相都含有较多的水，所以称为双水相，常用的双水相系统为PEG葡聚糖和PEG无机盐两种，后者应用更广泛。,一般认为，成相是由于聚合物之间的不溶性，即聚合物分子的空间阻碍作用，无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向。如用等量的11的右旋糖酐溶液和0.36甲基纤维素溶液混合，静止后，产生两相，上相中含右旋糖酐0.39，含甲基纤维素0.6

15、5，而下相中含右旋糖酐1.58，含甲基纤维素0.15。,5、超临界萃取技术 超临界流体萃取技术的优点是节能，对生化活性物质不产生热变性作用，可使用生理惰性溶剂在低温下分离活性组分。当在某一温度和压力时，气体和液体的物理特性就会趋于相同。两相变为一相，此时称为临界点，物质的临界点常数包括：临界温度、临界压力和临界密度。如CO2的临界点分别为31.1、7.3MPa和0.47gml，当温度和压力高于临界点值时，物质处于液体和气体的中间状态，在超临界状态下的流体称为超临界流体，超临界流体最常用的萃取剂是CO2。,超临界流体的物理特性、传质特性通常介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂。超临界流体具有与液

16、体同样的凝聚力、溶解力。密度与液体比较接近。随着温度和压力的连续变化，超临界流体扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍，超临界流体的黏度大大低于液体的黏度，接近气体的黏度，有利于物质的扩散。超临界流体的溶解力与其密度有很大关系，而密度又受到体系温度或压力的影响，所以压力或温度的变化都会直接改变其溶解能力。,（二）提取效率 提取时，总希望提取率愈高愈好，但实际上这种“相转移”的提取效率不可能达到100。在生物材料中总要残留部分目的物，残留量的多寡取决于所选择的溶剂系统的种类、用量、提取次数以及操作条件。在实际工作中，溶剂的用量有一定限量，所以一般用分次提取法予以弥补。一般生产上多用23次提取。溶

17、剂用量（L）为生物材料的25倍，少数情况也有用1020倍量溶剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。,当提取物由固相转入液相或从细胞内转到细胞外时，提取率还与物质的扩散作用有关。为了提高提取速度，常采取一些措施，如增加材料的破碎程度，进行搅拌，延长提取时间，提高提取温度。（三）影响提取效率的因素1、温度 多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。另外较高的温度可以降低物料的黏度，有利于分子扩散和机械搅拌。应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较低的温度下进行提取，一方面是为了减少溶剂挥发损失和生产安全，另一方面也是为了减少活力损失。,2、酸碱度 多数生化物质在中性条件下较稳定，所以提取

18、用的溶剂系统原则上应避免过酸或过碱，pH一般应控制在49范围内。为了增加目的物的溶解度，往往要避免在目的物的等电点附近进行提取。巧妙地选择溶剂系统的pH，不但直接影响目的物与杂质的溶解度，还可以抑制有害酶类的水解破坏作用，防止降解，提高收得率。,3、盐浓度 盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键的作用力。稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用。一些不溶于纯水的球蛋白在稀盐中能增加溶解度，这是由于盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，使之极性增加，水合作用增强，促使形成稳定的双电层，此现象称“盐溶”作用。多种盐溶液的盐溶能力既与其浓度有关，也与其离子强度有关，一般高价酸盐的盐溶作用比单价

19、酸盐的盐溶作用强。,常用的稀盐提取液有：氯化钠溶液（0.10.15molL）；磷酸盐缓冲液（0.020.05molL）；焦磷酸钠缓冲液（0.020.05molL）：醋酸盐缓冲液（0.100.15molL）：柠檬酸缓冲液（0.020.05molL）。其中焦磷酸盐的缓冲范围较大，对氢键和离子键有较强的解离作用，还能结合二价离子，对某些生化物质有保护作用。柠檬酸缓冲液常在酸性条件下使用，作用近似焦磷酸盐。,（四）提取方法的选择 生物材料及其目的物与提取有关的一些性状包括溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、相对密度、粒度、黏度、目的物含量、主要杂质种类及溶量解性质、有关酶类的特征等。操作者可根

20、据文献资料及本人的试验探索获得有关信息，在提取过程中尽量增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度，同时充分重视生物材料及目的物在提取过程中的活性变化。,对酶类药物的提取要防止辅酶的丢失和其他失活因素的干扰；对蛋白质类药物要防止其高级结构的破坏（即变性作用），应避免高热、强烈搅拌、大量泡沫、强酸 强碱及重金属离子的作用。多肽类及核酸类药物需注意避免酶的降解作用，提取过程中，应在低温下操作，并添加某些酶抑制剂；对脂类药物应特别注意防止氧化作用，减少与空气的接触，如添加抗氧剂，通氮气及避光等。,在提取过程中，如蛋白质、酶及核酸类药物常采用下列保护措施。（1）采用缓冲系统 防止提取过程中某些酸碱基团

21、的解离导致溶液pH的大幅度变化，使某些活性物质变性失活或因pH变化影响提取效果。在生化药物制备中，常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等，所使用的缓冲液浓度均较低，以利于增加溶质的溶解性能。,（2）添加保护剂 防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受破坏，如巯基是许多活性蛋白质和酶的催化活性基团，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸、巯基乙醇、二巯基赤鲜糖醇、还原型谷胱甘肽等。其他措施如提取某些酶时，常加入适量底物以保护活性中心。对易受重金属离子抑制的活性物质，可在提取时添加某些金属螯合剂，以保护活

22、性物质的稳定性。,（3）抑制水解酶的作用 抑制水解酶对目的物的作用是提取操作中的最重要保护性措施之一。如需要金属离子激活的水解酶（如DNase）常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液，使水解酶活力受到抑制。对热不稳定的水解酶，可用热变性提取法，使酶失活。根据酶的溶解性质的不同，可用pH不同的缓冲体系提取，以减少酶的释放或根据酶的最适pH，选用酶发挥活力最低的pH进行提取。最有效的办法是在提取时，添加酶抑制剂。,（4）其他保护措施 为了保持某些生物大分子的活性，还要注意避免紫外线、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频震荡等。有些活性物质还应防止氧化，如固氮酶、铜铁蛋白提取分离时要求在无氧条件下进行，有些活性

23、蛋白对冷、热变化也十分敏感，如免疫球蛋白就不宜在低温冻结。所以提取时要根据目的物的不同性质，具体对待。,三、生化活性物质的浓缩与干燥（一）生化活性物质的浓缩 生化活性物质提取液在进一步分离、提纯前，根据物料性能可采用不同方法浓缩，由于多数生化活性成分对热不稳定，因此常采用一些较为缓和的浓缩方法。1、盐析浓缩 用添加中性盐的方法来使某些蛋白质（或酶）从稀溶液中沉淀出来，从而达到样品浓缩的目的。最常用的中性盐是硫酸铵，其次是硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钾等。,2、有机溶剂沉淀浓缩 在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇、丙酮等有机溶剂，可以使生化物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来，这也是浓缩生物

24、样品的常用方法。其优点是溶剂易于回收，样品不必透析除盐，在低温操作下，对多种生物大分子较为稳定，但对某些蛋白质或酶却易使它们变性失活，应小心操作。应用本法获得的浓缩物，为防止生物活性物质变性应尽快除去有机溶剂。,3、用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩 加入固体的干葡聚糖凝胶G25，缓慢搅拌30min，葡聚糖凝胶吸水膨胀，进行吸滤，生物大分子全部留在溶液中，如此重复数次，可在短时间内使溶液浓缩到l00ml，每次葡萄糖凝胶的加入量为溶液量的15为宜，用过的葡聚糖凝胶经蒸馏水洗净后，可用乙醇脱水，干燥后重复使用。,4、用聚乙二醇浓缩 将待浓缩液放入透析袋内，袋外覆以聚乙二醇，袋内的水分很快被袋外的

25、聚乙二醇所吸收，在极短时间内，可以浓缩几十倍至上百倍。5、超滤浓缩 应用不同型号超滤膜浓缩不同分子量的生物大分子。,6、真空减压浓缩与薄膜浓缩 真空减压浓缩在生物药物生产中使用较为普遍，浓缩的目的是除去挥发性溶剂，保持物料的生物活性，如薄膜蒸发器便是其中一例。薄膜蒸发的进行方式有二：一是使液膜快速流过加热面而蒸发，另一是使物料剧烈地沸腾，产生大量泡沫，以泡沫的内外表面为蒸发面进行蒸发，后一方法使用较普遍。,（二）干燥 干燥是使物质从固体或半固体状经除去存在的水分或他种溶剂，从而获得干燥物品的过程。水分在干燥的物料中，有三种情况：即表面水、毛细管中的水与细胞内的水。表面水很容易通过汽化除去。毛细

26、管中的水，由于毛细管壁的作用，较难除去。细胞内的水由于被细胞膜包围封闭，如不扩散到膜外则不容易蒸发除去。,干燥速度在温度及压力不变的条件下取决于液体到达表面的速度。物质在空气中的干燥度，也常称为物质的平衡湿度，在一定条件下是一个不变值。因此，除非改变大气的温度，湿度或压力。干燥多用加热法进行。常用的方法有膜式干燥、气流干燥、减压干燥等。此外，冷冻干燥、喷雾干燥以及红外线干燥等也常选用。,1、减压干燥 减压干燥是在密闭容器中抽去空气后进行干燥的方法，亦称真空干燥。2、喷雾干燥 喷雾干燥是流化技术用于干燥的最早方法。待干燥的物质先浓缩成一定浓度的液体。由于液体经喷雾后具有极大的表面，故能在很短时间

27、内干燥，使受热时间缩短，而且干燥物为粉状，不需粉碎即可应用。,3、冷冻干燥 冷冻干燥是在低温、低压条件下，利用水的升华性能而进行的一种干燥方法。在预冻结过程中，制品的预冻有两种方式：其一是制品与干燥箱同时降温；另一种是待干燥箱搁板降温至40左右，再将制品放入。前者相当于慢冻，后者则介于慢冻与速冻之间。,冷冻干燥机系由制冷系统、真空系统、加热系统、电器仪表控制系统所组成，主要部件为干燥箱、凝结器、冷冻机组、真空泵组和加热装置等（图2 3）。,四、生化活性物质的分离与纯化1、生化制药工艺中分离制备方法的特点 生化分离技术包括：生化分离分析和生化制备。前者主要对生物体内各组分加以分离后进行定性、定量

28、鉴定。而后者则主要是为了获得生物体内某一单纯组分。生物制药工艺中分离制备方法有下列特点：（1）生物材料组成非常复杂。其中有不少化合物迄今还是未知物，而且生物活性物质在分离进程中仍处于不断代谢变化中，因此常无固定操作方法可循。,（2）有些化合物在生物材料中含量极微，因此分离操作步骤多，不易获得高收率。（3）生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，必须十分小心地保护这些化合物的生理活性，这也是生物制药中分离、制备的难点。（4）生物制药中的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度、pH、离子强度等）对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。实验结果常常带有很大经验成分。,（

29、5）为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中的分离方法多采用温和的“多阶式”方法进行，即常说的“逐级分离”方法。（6）生物产品最后均一性的证明与化学上纯度的概念不完全相同，因生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂，故对其均一性的评估常常是有条件的，只凭一种方法得到的纯度结论往往是片面的，甚至是错误的。,2、生化制药工艺中分离制备方法的基本原理生物大分子分离纯化的主要原理是：（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心、膜分离（透析、电渗析）超滤法 凝胶过滤法。（2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离。如离子交换法、电泳法、等电点聚焦法。（3）根据分子极

30、性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。,（5）根据配体特异性进行分离亲和层析法。3、分离纯化的基本程序和实验设计 生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致可分为五个基本阶段：（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法；（2）制备物的理化性质和稳定性的预备试验；（3）材料处理及抽提方法的选择；,（4）分离纯化方法的摸索；（5）产物的均一性测定。提取是分离纯化目的物的第一步，所选用的溶剂应对目的物具有最大溶解度，并尽量减少杂质进入提取液中，为

31、此可调整溶剂的pH、离子强度、溶剂成分配比和温度范围等。分离纯化是生化制备的核心操作。所以合理的分离纯化方法是根据目的物的理化性质与生物学性质依具体实验条件而定。根据分析和预试验的初步结果，参考别人对类似物质的分离纯化经验，也可以少走弯路。,4、分离纯化方法步骤优劣的综合评价 每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性二方面考虑外，还要注意方法本身的回收率。5、制备物均一性的鉴定 一个制备物是否纯，常以“均一性”表示。均一性是指所获得的制备物只具有一种完全相同的成分。均一性的评价常须经过数种方法的验证才能肯定。,如果某物质所具有的物理、化学各方面性质经过几种高灵敏度方法的鉴定都是均一的，

32、那么大致可以认为它是均一的。当然，随着更好的鉴定方法的出现，还可能发现它不是均一的。绝对的标准只有把制备物全部结构搞清楚，并经过人工合成证明具有相同生理活性时，才能肯定制备物是绝对纯净的。生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度法、化学组成分析法、电泳法、免疫学方法、离心沉降分析法、各种色谱法、生物功能测定法，以及质谱法等。,第二节 微生物制药工艺技术基础、微生物菌种的选育与菌种保藏（一）菌种的分离与筛选1、菌种的分离（1）含菌样品的收集 根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需菌种，一般可从土壤中分离。,（2）富集培养 收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。若含所需要的菌很少，就

33、需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利筛选。再配合控制温度、pH或营养成分即可达到目的。（3）菌种的纯化 在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生长，所以要进行分离，以获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离法或划线分离法。2、菌种的筛选 筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。,（二）菌种的选育与保藏1、菌株的选育 发酵生产，从自然界直接分离到的菌种，都不能适合实际生产需要。只有通过诱变、选育才能使产量成倍、成百倍地提高。（1）自然选育 自然选育是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株。因此，它能达到纯

34、化、复壮菌种，稳定生产的目的。自然选育一般包括单孢子悬浮液的制备、分离及单菌落培养、筛选等操作过程。,（2）诱变育种 诱变育种是指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。出发菌株的选择 出发菌株是用于诱变的原始菌株，选择出发菌株时，应考虑以下问题：a、出发菌株的稳定性，尽量挑选纯系菌株，以排除异核体系与异质体菌株，因此对选定的出发菌株常需通过自然选育进一步纯化；,b、选用具备某种优良特性的菌株。c、拟选对诱变剂敏感的菌株，以提高突变频率；d、菌种的生理状态及生长发育时间，因为诱变剂对处于转录状态或翻译状态

35、的菌种效应要比静止状态或休眠状态的菌种敏感得多。一般细菌处于营养体，比处于对数生长期的菌体为佳。真菌和放线菌则以它们的孢子，或处于刚开始萌发状态的孢子为佳。为了保证菌体和诱变剂均匀接触，出发菌株都必须制备成单细胞（孢子）悬浮液，严格控制单孢子的分散度在95以上。,诱变处理 能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。目前使用的诱变剂可分为物理诱变因子、化学诱变剂和生物诱变因子三大类。多次反复用同一种诱变因子处理易出现“饱和”或回复突变现象，因此常采用多种不同的诱变因子或复合因子诱变。a、物理诱变：物理诱变因子主要包括紫外线（UV）、射线、射线、快中子（FN）、射线、超声波、激光等，其中以紫外线辐照

36、使用最为普遍。近年来用离子束注入细胞技术进行诱变育种。,b、化学诱变：化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。化学诱变剂据其与DNA作用方式不同有3类：烷化剂如氮介、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基脲、亚硝酸等，它们与DNA碱基起反应，引起碱基配对的转换而发生遗传变异；,碱基类似物，它们掺入到DNA分子中而导致遗传变异如5溴尿嘧啶（5BU）、5氟尿嘧啶（5FU）等；移码诱变剂如吖啶黄、吖啶橙等。它们可插入DNA双螺旋的邻近碱基对之间造成碱基的插入或缺失导致转录和翻译的移码突变。,c、生物诱变：噬菌体可作为诱变剂应用于抗噬菌体菌种的选育，其作用原理可能与

37、传递遗传信息，诱发抗性突变有关。诱变剂量的选择能够提高正变株获得率的诱变剂量即为最适剂量，一般情况下，诱变处理后的细胞死亡率越高，活下来的细胞的突变率也越高，故可用死亡率作为相对剂量。在自动化程度高的大规模筛选中，常采用死亡率在9099.9的高剂量，小规模的人工筛选，一般采用死亡率7090的低剂量，也有报道采用死亡率4060的更低剂量。,增变剂的使用，氯化锂本身并无诱变作用，但在抗生素产生菌的诱变育种中表明氯化锂与一些诱变因子具有协同作用。氯化锂使用剂量一般为0.5，处理方法多是后处理，即加在平板培养基中，在菌种的生长发育过程中发生作用。,突变株的筛选 a、随机筛选：随机筛选指菌种经诱变处理后

38、，凭经验随机选择一定数量的菌落，其中包括未发生突变的野生型菌株和发生突变后的正向及负向突变株，再进行摇瓶筛选。b、半理性化筛选：近年来，随着遗传学、生物化学知识的积累，人们对多种抗生素生物合成途径及代谢调控机制的了解不断深入，抗生素产生菌的推理选育技术应运而生、即根据已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来设计筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。,（3）现代菌种选育技术 杂交育种 杂交育种一般指将两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。杂交育种是选用已知性状的供体菌株和受体菌株作为亲本，把不同菌株

39、的优良性状集中于重组体中。因此杂交育种具有定向育种的性质。杂交育种使得遗传物质重新组合，扩大了变异范围，改善了产品质量和产量。,原生质体融合 用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇（PEG）促进原主质体发生融合，从而获得融合子，这一技术叫原生质体融合。原生质体融合的重组频率高于普通杂交方法，并实现了种间、属间的融合，为亲缘关系较远的、性能差别较大菌株实现杂交，开辟了一条有效的途径。,基因工程技术 基因工程技术可完成超远缘杂交，是将某一生物体（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一微生物体（受体）细胞中，使外源DNA片段在后者内部得以

40、表达和遗传。所以基因工程是在分子生物学理论指导下的一种自觉的、能像工程一样可事先设计和控制的育种技术。,2菌种的保藏（1）菌种的退化与防止 退化意味着随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减退或消失。一般把菌株的生活力、产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化。菌株的遗传性状是稳定的，但是也可能发生突变。因此，可以在基因型改变的情况下引起菌种退化。在传代过程中回复突变的数量逐步取得优势的过程，也就是菌种退化的过程。所以基因突变可以使原来纯的菌株变为不纯，不纯菌株在传代过程中不断增加比例，从而导致群体的退化。,菌种退化现象的综合比较鉴别是：单位容积中发酵液的活性物质含量；琼脂平皿上的单菌落形

41、态；不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征，如形成孢子能力；发酵过程的pH变动情况；发酵液的气味、色泽。,菌种退化问题十分复杂，对其规律尚缺乏了解。所以，只能提供一些原则性防止措施。防止基因突变，基因突变是菌种退化的一个重要原因，应用低温保藏法可以减少突变的发生；采用双重缺陷型，利用营养缺陷型作为生产菌株时，回复突变可导致产量下降，采用双重缺陷标志可间接而有效地防止突变；制定科学管理制度，使用菌种时大批制作平行的菌种斜面，少转接传代；分离单菌落，在建立新菌株和使用过程中认真进行单菌落分离，再多制作平行的菌种斜面；,选择培养条件，选择有利高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。（2）常用的菌种保藏

42、法 微生物菌种在多次传代中，会发生遗传性的变异，而且退化性的变异是大量的，所以微生物菌种应妥善保藏，使之能长期保持存活、不退化，便于生产和科研使用。菌种保藏的原理是根据菌种的生理、生化特点，创造条件使菌体的代谢处于不活泼的状态。,保藏时，先挑选优良的纯种，最好是选取它们的休眠体（孢子、芽孢等），然后创造一个最有利于休眠的环境条件（如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等），以降低菌种代谢活动的速度，达到延长保存期的目的。一种较好的保藏方法，首先要求能较长期地保存原有菌种的优良特性，但也要考虑方法本身的经济简便。,斜面低温保藏法。斜面低温保藏法是最早使用的而且现今仍然普遍采用的方法。具体方法是将菌种接

43、种于所要求的斜面培养基上，置最适温度下培养，待得到健壮的菌体后，放在4左右，湿度小于70的条件下保藏，每间隔一定时间重新移植培养1次。一般，细菌每月移植一次，放线菌每3个月移植一次，酵母菌每46个月移植一次，丝状真菌每4个月移植一次。保存期间应注意冰箱温度，不能波动太大，切忌保存在0以下，否则培养基会结冰脱水，造成菌种性能的衰退。,液体石蜡封藏法。在长好菌苔的斜面试管中，加入灭过菌的液体石蜡，可防止或减少培养基内水分蒸发，隔绝培养物与氧的接触，从而降低微生物的代谢活动，推迟细胞老化，延长了保存时间。适用于不能利用石蜡油作碳源的微生物的保藏。方法为选用优质纯净无色中性的液体石蜡，经121加压蒸汽

44、灭菌30min，然后在150170烘箱中干燥12h，使水汽蒸发，石蜡油变清。再按无菌操作将灭菌的石蜡油注入长好菌苔的斜面试管中，液面高出斜面1cm。,冷冻干燥保藏法。冷冻干燥保藏法是在较低的温度下（15以下），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。为防止冻结和水分不断升华对细胞的损害，采用保护剂来制备细胞悬液。常将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥，经过冷冻干燥的微生物的生长和代谢活动处于极低水平，因此菌种可以保存很长时间，一般5l0年，最多可达15年之久。真空冷冻干燥保藏法是目前保存菌种的一种比较好的方法。,液氮超低温保藏法 微生物在130的低温下，所有的代谢

45、活动暂时停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。可通过加入保护剂来降低细胞内溶液的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。其方法是以510的甘油或二甲亚砜（DMSO）制成孢子悬液或菌悬液，浓度以大于108为宜。将此悬液注入无菌的安瓿管或聚丙烯小管内，密封。采用专用冷冻温度控制仪以每1min降低1的速度，从0降到35，然后取出直接放入液氮中。保藏的菌种如需用时，将安瓿管由液氮中取出，立即置于3840温水浴中，振荡，直到全部融化为止，开启移种。此法是目前最可靠的一种长期保存菌种的方法。,甘油冷冻保藏法。将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15消毒甘油、混匀速冻，冻存于7080，可保存35年。其他干燥保藏法 保

46、藏微生物菌种最关键的要点是干燥、隔氧、低温、避光。单就干燥原理将微生物细胞或孢子附着在一种基物上进行干燥，然后加以保存。例如用沙、土或沙土混合，明胶、硅胶、滤纸、麸皮、陶瓷玻璃珠等作附着剂或载体粘连上细胞，干燥后保存。最常用的如沙土保藏法。,沙土管保藏法的操作如下：取细沙除去有机杂质及铁屑，过4060目筛；取庭园土过100120目筛，洗净。将细土与沙按1：2（质量百分比）混合，分装入小管内约2cm高，加棉塞，于121灭菌lh，间歇灭菌35次。将菌苔已长好的斜面，注入无菌水35ml，用接种针轻轻将菌苔刮下，制成菌悬液，接种0203ml菌悬液入沙土管中，然后放在装有干燥剂（如无水氯化钙）的真空干燥

47、器中，接通真空泵，抽干（一般46h即可抽干，管内沙土成松散状）。干燥后的沙土管放在干燥器内置4冰箱中保存。此法适用于产孢子的微生物，也是保存抗生素产生菌常用的方法。其缺点是存活率低，变异率高。,（3）菌种保藏的注意事项 在整个保存处理过程中要防止杂菌污染，并一定要做无菌检查；保藏所用的菌种要在新鲜的斜面上生长丰满，生长时间不宜过长；保藏过程中要防止菌种退化现象的发生，及时采用有效方法复壮，传代次数过多容易退化；菌种制备过程是保持菌种优良特性的一个重要环节。接种斜面不宜过密，接种量必须控制适当，使菌落能充分生长好。,二、微生物的培养（一）微生物生长的六大营养要素 微生物要维持其正常生命活动，必须从外界环境中不断摄取必需的能量和物质，凡具营养功能的物质称为营养物，光可提供光能自养微生物的能源，故也属于某些微生物的营养物。1、碳源 凡能提供微生物营养所需碳元素（有机物的碳架）的营养源，称为碳源。微生物可利用的碳源是生物界中最广的。,2、氮源 凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源，称为氮源。与碳源谱相似，微生物能利用的氮源类型即氮源谱也是生物界最为广泛的。3、能源 凡能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能称为能源。由于各种异养微生物的能源就是其碳源，故其能源谱就显得十分简单：,