生物信息技术应用分子序列比对分析.ppt

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1、生物信息技术应用,分子序列比对分析,Sequence alignment,Contents,序列比对的应用,序列数据库,基本类型：初级数据库 收录、存储序列的基本数据资源，如核酸（蛋白质）序列、蛋白质空间结构及基因组信息。次级数据库 在初级库资源基础上进行整理和标注，为特定专业领域服务的派生数据库，如表达序列标记、微列阵（基因芯片）、代谢和信号途径、遗传疾病数据库、免疫数据库等等。,核酸序列数据库,以核苷酸顺序及注释信息为基本内容的数据库世界三大核酸数据库GenBank in USA(http:/)EMBL in Europe(http:/)DDBJ in Japan(http:/)1998年

2、，GenBank,EMBL,DDBJ共同成立国际核酸序列数据库协会(INSDC,http:/)，实现了全球范围内的核酸序列的同步更新和交换互享。,蛋白质序列数据库,以蛋白质氨基酸顺序及注释信息为基本内容的数据库世界主要蛋白质序列数据库(1)PIR-PSD(Protein information resource-protein sequence database)founded by NBRF of USA(美国国家医学研究基金会)in 1984(http:/)1988年，日本国际蛋白质信息库(JIPID)和德国慕尼黑蛋白质序列信息中心(MIPS)加入PIR，合作成立了国际蛋白质信息中心（PI

3、R-International）。PIR为较全面和权威注释的蛋白质数据库，具有非冗余、高质量注释和分类全面等特点。,蛋白质序列数据库,世界主要蛋白质序列数据库(2)SwissProt 1986年始创于瑞士日内瓦大学，现由瑞士生物信息学研究所(SIB)和欧洲生物信息学研究所(EBI)共同管理和维护。(http:/)SwissProt数据库的特点：所有序列条目经过专家核实，可靠性与可信度高；注释详细，包括蛋白质的功能、序列及结构域的结构、翻译后修饰及其位点、突变体等,蛋白质序列数据库,世界主要蛋白质序列数据库(3)TrEMBL(translation of EMBL)建立于1996年，是从EMBL

4、中的cDNA序列翻译得到的蛋白质数据库。相似的还有GenPept(GenBank)数据库。TrEMBL、GenPept数据库的特点：序列条目来自核酸序列库的翻译，即时性强；但未经专家的注释、分析和核实，因而错误率和冗余度都较高。,蛋白质序列数据库,全球统一的蛋白质序列与功能数据库UniProt(Universal Protein Resource,通用蛋白质资源)(http:/)2002年，PIR、SIB、EBI合并了分属其下的PIR-PSD、Swiss-Prot和TrEMBL数据库，形成了统一的蛋白质数据库UniProt截止2008年8月，UniProt共收录蛋白质序列 6,462,751个

5、,生物大分子结构数据库,以生物大分子各原子空间信息为基本内容的数据库给定序列的蛋白质如何折叠为稳定、具一定生物功能的三维结构？信息来源：对蛋白质晶体的X射线衍射、核磁共振及冷冻电镜分析主要数据库：美国Brookhaven国家实验室的PDB(Protein Data Bank,1971年成立)联合MSD-EBI、PDBj，于2003年组建全球共享的worldwide PDB(wwPDB)(http:/)截止2008年8月，共收录蛋白质结构52684个,Research Collaboratory for Structural Bioinformatics,http:/,GenBank,Natio

6、nal Center for Biotechnology Information(NCBI)National Library of MedicineNational Institutes of Healthhttp:/,GenBank,http:/,全球著名的生物信息综合数据库 GenBank（1982年成立）包含所有已知的核苷酸及蛋白质序列以及与之相关的生物学信息和参考文献，现由美国生物技术信息中心（NCBI，成立于1988年）管理维护，是世界上的权威序列数据库。数据库序列的来源为作者直接递交或间接查寻文献所得，并与世界上其他公开发行的数据库，如EMBL，DDBJ交换每日更新的数据。,Gen

7、Bank,GenBank 核酸数据库的增长（1982-2008）,截止2008年2月，GenBank 共收录核酸序列近8300万条，约860亿碱基对，来自26万余种生物,GenBank,http:/Home page,NCBI 数据库检索系统 Entrez,Entrez为基于万维网的NCBI数据库检索系统，通过输入关键词，运用布尔算符，可在NCBI所有数据库中进行文本搜索。,NCBI 数据库检索系统 Entrez,Entrez为基于万维网的NCBI数据库检索系统，通过输入关键词，运用布尔算符，可在NCBI所有数据库中进行文本搜索。,NCBI 数据库检索系统 Entrez,Entrez 应用举例

8、,检索主题：小鼠(mouse)转录因子(TF)-E2F mRNA的核酸序列检索过程：NCBI主页All Databases在Search对话框输入关键词”E2F”，点”Go”输出检索结果。,Entrez 应用举例,输出相关序列3784条，有待进一步筛选：限制物种来源(小鼠 Mus musculus)、限制分子为mRNA(排除未经实验验证的预测序列)。,Entrez 应用举例,最后命中168条，从中选中NM_148952，以待详细分析。,Entrez 应用举例,NM_148952：小鼠E2F转录因子-4。,序列文件格式：FASTA 格式,标题行：文件的第一行，以大于号“”开始，不换行。内容可自定

9、义，包括基本信息和简单注释；序列行：文件第二行起至结束，中间不得有空格。FASTA为最简单的序列（核酸或蛋白质）格式,序列文件格式：GenBank 格式,GenBank 格式注释信息丰富全面，属文本文件，包括4部分：头部：含名称、定义、识别码、物种来源等基本信息；引文区：含相关文献信息。序列特征表：含序列的编码区、非编码区、功能域、修饰或突变位点、翻译序列等众多注释信息序列区：序列本身,GenBank 格式,Locus 行信息：Locus name；Sequence length;Type of Molecule:DNA,mRNA,cDNA Taxonomy：PRI primate(灵长类)、

10、ROD rodent(啮齿类)、MAM-other mammalian(其它哺乳类)、VRT-other vertebrate(脊椎动物）、INV invertebrate sequences、PLN-plant,fungal,and algal;BCT-bacterial;VRL-viral,PHG-bacteriophage,SYN-synthetic;UNA-unannotated;EST-expressed sequence tags Date:上传或最近修改时间,GenBank 格式,GenBank 格式,GenBank 格式,/,成对序列比对与BLAST工具,序列比对概念：通过比较

11、两个或两个以上的核酸(蛋白质)序列，显示其中相似的结构区域。成对序列比对(pairwise sequence alignment)多重序列比对(multiple sequence alignment)功能:(1)“相似”的序列“相似”的三维结构；(2)“相似”的序列“相似”的功能；(3)“相似”的序列 共同的进化起源,序列比对是序列分析（结构、功能与进化关系）的基础,序列比对相关概念,相似性(Similarity)：序列间相同碱基或氨基酸残基所占比例的高低，是直观的数量关系，是序列间匹配程度的直接测度。同源性(Homology)：核酸或蛋白质序列间具有共同起源，是依据进化事实的因果判断。直系同

12、源(orthology)：经由物种分离事件形成的存在于不同物种中的结构及功能相似的序列旁系同源(paralogy)：经由基因复制而演化形成在同一生物体的一系列结构及功能相似的序列序列的相似与序列的同源之间无必然的因果关系（相似并不一定同源），但存在一定的相关性（足够的相似性往往意味着同源关系的存在）,成对序列比对,用于两个核酸（蛋白质）序列间相似性比较，是生物信息学的基本技术，是多重比对的基础。The process of lining up two sequences to achieve maximal levels of identity(or conservation,in the c

13、ase of amino acid sequences)for the purpose of assessing the degree of similarity and the possibility of homology.,DNA、蛋白质序列比对,Query:181 catcaactacaactccaaagacacccttacacccactaggatatcaacaaacctacccac 240|Sbjct:189 catcaactgcaaccccaaagccacccct-cacccactaggatatcaacaaacctacccac 247,RBP:26 RVKENFDKARFSGTWY

14、AMAKKDPEGLFLQDNIVA 59+K+GTW+MA+L+A glycodelin:23 QTKQDLELPKLAGTWHSMAMA-TNNISLMATLKA 55,成对序列比对,全局比对（global alignment）比较结果包含所比较序列全长范围内所有位点的比对，适用于整体相似水平高的同源序列，在分子系统学中常用。局部比对（local alignment）仅对相似水平较高的 局部片段进行比对，多用于分子结构和功能域研究。,成对序列比对举例,视黄醇结合蛋白(RBP)与水解牛乳蛋白(-lactoglobulin)的比对结果,完全相同区,部分相似区,identity,Similari

15、ty,Gap,间隔,成对序列比对,完全匹配（complete match）部分匹配（partial match）对于蛋白质序列而言，不同但性质(size,charge,hydrophobicity,and polarity)相近的氨基酸常具有相似的功能。碱性aa、酸性aa、中性-非极性aa、极性aa空位（gap）源于序列片段的插入或缺失(insertion or deletion)序列比对不同算法对于空位的处理方式有所不同，这直接影响了算法的适用性,局域比对搜索工具 BLAST,Basic Local Alignment Search Tool基于BLAST算法（Altschul et al,

16、1990）的序列比对搜索工具，由NCBI研发并维护，因其快速可靠、功能全面且使用方便而被广泛运用。现行的BLAST算法为BLAST2。,BLAST 应用示例,大肠杆菌乳糖操纵子(lactose operon)翻译的一个蛋白质序列：,MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAELNYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGVEACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSHEDGTRLGVEHLVALGHQQIAL

17、LAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSAMSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSCYIPPSTTIKQDFRLLGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPRALADSLMQLARQVSRLESGQ,用NCBI的BLAST工具对该序列进行数据库检索和序列比对分析,http:/,BLAST 应用示例,BLAST 应用示例,NCBI翻译库(nr)Refseq专家库SwissProt欧洲专家库Pat专利库Pdb三维结构库,BLAST 应用示例,BL

18、AST参数设置（蛋白质对位）,过滤器去除待测序列中重复序列干扰,相似程度降低,期望阈值,E值阈值才计入结果，故阈值越小，匹配条目越少,替换矩阵,对各种可能的对位方式赋予适当的分值。用于DNA序列比对的碱基取代矩阵(考虑转换与颠换的进化频率差异),用于蛋白质序列比对的取代矩阵，需考虑不同蛋白质家族在进化中由一种氨基酸突变为另一种氨基酸的概率差异，根据不同的蛋白质家族和预期的相似程度构建不同的取代矩阵。如PAM(by Dayhoff)和BLOSUM(by Henikoff)矩阵。,A hypothetical substitution matrix,空位罚分,对出现空位的罚分规则是人为设定的，缺乏

19、统一的客观标准。Linear gap penalty:对所有空位均采用一致的罚分Affine gap penalty:对空位首次出现(d=-4)和空位延续罚分(e=-1)区别对待,BLAST 应用示例,BLAST结果输出（产生100个相似序列，相似度由高到低排列）：,BLAST 应用示例,BLAST统计判断(什么是E-value?)Alignment score(S)：x零假设(H0)：待测序列与某一个库存序列的匹配是源于随机事件的概率P-value=P(S=x|H0)其服从极值分布函数 E-value P*N(设数据库中有N条库存序列，Px时由随机偶然因素产生的对位结果的次数（E=1出现一次

20、错误对位）。根据需要设定E-value的阈值，默认值为10，更严格的搜索需设置更小的阈值，如1。,BLAST 应用示例,相似度最高的检索序列(Sbjct)与被测序列(Query)的比对：,结论：待测序列应是大肠杆菌乳糖操纵子阻遏蛋白，与库存蛋白有一个错配(LS),BLAST 应用示例,相似度第二高的检索序列与被测序列的比对：,42%完全匹配，60%相同或性质相近(+)，无间隔。两序列间可能存在很高的同源性,克氏肺炎杆菌 Klebsiella pneumoniae乳糖操纵子阻遏蛋白,BLAST 应用示例,使用过滤器的必要性,agaggccagagagggtgtcggatcccctagacctgt

21、agtctcggacggttgttagctgacgtgtaggtgctgggagataaacccggacgctctggaggaccagtcagtcagctcttagcccctgagccctctctcctcaattgtatctttcaacttaattttctactaaaatcttttaatactttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa,用BlastN工具进行数据库检索和序列比对分析，若不用过滤器，则：,PolyA尾巴,可能出现大量无关的假命中,BLAST 应用示例,使用过滤器的必要性,用BlastN工具进行数据库检索和序列比对分析，若用过滤器，则：,用N替代a,过滤掉简单重复序

22、列(low complexity),多重序列比对与Clustal工具,多重序列比对(Multiple sequence alignment)就是把两条以上可能有系统进化关系的序列同时进行比对的方法。,如果序列总体相似程度低，则成对比对往往不能发现一些局部匹配。而通过多重比对，能大大增加发现这些相似结构域的几率，而这些结构通常具有重要的生物学意义。,多重比对工具,运用最多的多重序列比对方法 Clustal算法 By Feng&Doolittle，1987包括clustalW,clustalX由于最终的多重排列依赖起始的序列对，最紧密相关的起始对位中的可能错误会随多重比对的进行而累积扩增，尤其在起

23、始排列为远缘序列时，问题更明显。因此Clustal算法较适合于近缘的序列比对。现有多重比对算法都不能保证获得最佳比对结果，只是个近似解，往往需要人工分析并作出改进,ClustalW,EBI在线多重比对工具,ClustalW应用示例,步骤：输入FASTA格式的系列序列，可直接粘贴或上传文件“Run”,ClustalW应用示例,步骤：程序运行显示结果输出表Output fileAlign fileGuide tree fileInput file,ClustalW应用示例,系统进化树图(旁系同源),ClustalW应用示例,“*”号：完全相同的残基位点；“.”号：有较高相似性的残基位点（分子大小与

24、极性基本一致）;“.”号：相似性略低的残基位点（分子大小或极性基本一致）,红色:AVFPMILW(小分子非极性氨基酸)兰色:DE(酸性、负电氨基酸)紫色:RHK(碱性正点氨基酸)绿色:STYHCNGQ(带羟基、氨基的极性氨基酸),ClustalX,单机版Clustal多重比对工具。版本2.0输入序列多用Fasta格式,ClustalX应用示例,步骤：载入FASTA序列“Do Complete Alignment”指定输出文件，包括：“指导树”文件(后缀dnd)“对位输出”文件(后缀aln),比对结果：用彩条和符号标出相似程度高的位点 对位结果可通过调整参数进行调整，以寻找最佳对位，帮助挖掘其中

25、的生物学意义,序列比对的应用,两两比对在序列库中对某目标序列进行比较认定用EST或蛋白序列与核酸序列的比对，确定编码区，用于基因预测多重比对通过比对寻找、分析保守区域（conserved region）：发现新的基序(motif)用于基因家族或蛋白质家族分析 建立分子系统进化树通过与已知基因的比对，对未知基因结构进行预测通过与结构已知的蛋白质的比对，对未知蛋白的三维结构进行预测,多重序列比对寻找保守的序列基序,球蛋白(globin)的多重比较,多重序列比对寻找保守的序列基序,多重比对发现调控序列的保守结构,如：转录启动子的保守区域-10，-35 sequence,用BLAST 进行蛋白质家族分

26、析和寻找保守域,用BLAST 进行蛋白质家族分析和寻找保守域,Pfam(Protein Domain Families database)包括每个蛋白质家族的多重比对信息,用BLAST 进行蛋白质家族分析和寻找保守域,结果解读：该蛋白序列有一个保守域，属离子转运超家族(Ion_trans_2 superfamily),位置在60-110aa之间,ClustalX应用示例,Ning Zheng et al.1999 Genes&Development,RRXYD:DNA recognition motif,BLAST 练习,要求：用NCBI BlastP比对搜索该蛋白质的名称、序列号、物种来源等

27、基本信息；通过BLAST寻找其在小鼠(Mus musculus)中亲缘最近的同源蛋白，提供比对结果;通过Special BLAST推断该蛋白属于何种蛋白质家族、可能的保守域的名称,MALAGAPAGGPCAPALEALLGAGALRLLDSSQIVIISAAQDASAPPAPTGPAAPAAGPCDPDLLLFATPQAPRPTPSAPRPALGRPPVKRRLDLETDHQYLAESSGPARGRGRHPGKGVKSPGEKSRYETSLNLTTKRFLELLSHSADGVVDLNWAAEVLKVQKRRIYDITNVLEGIQLIAKKSKNHIQWLGSHTTVGVGGRLEGLTQDL

28、RQLQESEQQLDHLMNICTTQLRLLSEDTDSQRLAYVTCQDLRSIADPAEQMVMVIKAPPETQLQAVDSSENFQISLKSKQGPIDVFLCPEETVGGISPGKTPSQEVTSEEENRATDSATIVSPPPSSPPSSLTTDPSQSLLSLEQEPLLSRMGSLRAPVDEDRLSPLVAADSLLEHVREDFSGLLPEEFISLSPPHEALDYHFGLEEGEGIRDLFDCDFGDLTPLDF,两两比对,BLAST 练习,要求：已知拟南芥(Arabidopsis thaliana)转录因子E2F家族包含6个成员，分别为E2Fa,E2Fb,E2Fc,E2Fd,E2Fe,E2Ff，请通过Entrez查寻其蛋白质序列信息，并将结果保存为FASTA格式；建立上述蛋白的多重比对FASTA文件；用ClustalW进行多重比对，将结果保存下来以便分析,多重比对,用NCBI BlastP比对搜索该蛋白质的名称、序列号、物种来源等基本信息,通过BLAST寻找其在小鼠(Mus musculus)中亲缘最近的同源蛋白，提供比对结果,通过Special BLAST推断该蛋白属于何种蛋白质家族、可能的保守域的名称,