血液分析仪检验临床检验基础.ppt

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1、血液分析仪及其临床应用,hematology analyzer and clinical application,重点:1、血液分析仪测定的原理、方法2、血液分析仪各参数临床意义,血液分析仪,自动血液分析仪（automated hematology analyzer,AHA)，早年称血细胞计数仪（blood cell counter)是目前国内外临床检验最常用的筛检仪器之一。,Coulter,1947年发明了利用电感应区检测颗粒大小和数目的库尔特原理1953年，制造出世界上第一台颗粒粒度分析仪，成为颗粒计数经典方法1958年，库尔特公司成立创办库尔特基金，热心社会公益事业。,库尔特（美国通用电

2、气公司员工）在上海工作时所拍照,库尔特与李俊的差别:社会价值观的差别,日照香炉生紫烟，疑似熊猫在烧香。06年毒王“熊猫烧 香”电脑病毒。病毒原始制作者25 岁的网络天才李俊。,正确社会价值观:敬业、爱心、责任感,血细胞分析仪近年来的发展变化,1.血常规检验多参数化2.多功能合成扩展3.检测速度的提高4.方法的改进和进展5.应用的方便性,一 血液分析仪检测原理,检测原理,电学,光学,电阻抗法,激光散射法,射频电导法,分光光度法,P93,血液分析仪功能：,全血细胞计数功能。白细胞分类功能。扩展功能。,2 库尔特原理图,电极和稀释液构成电流回路 细胞通过小孔 电极感应电阻变化，将其转换成脉冲 脉冲的

3、数量代表细胞数量 脉冲大小反映细胞体积大小。,脉冲检测器,（一）电阻抗法原理（库尔特原理）,1 库尔特原理 利用电阻抗法测量细胞的数量和体积。血细胞是电的不良导体，当一个细胞通过计数小孔时，会导致小孔两端电阻的变化，将其转化成脉冲，感应器通过检测脉冲的数量及大小，从而计算出通过小孔的细胞数量及体积。,细胞体积越大，脉冲振幅越高；细胞数量越多，脉冲数量也越多。,3 电阻抗法仪器的主要组成,电阻抗法仪器的主要组成包括：信号接收器各种微粒通过检测小孔产生电阻抗脉冲信号的检测源。放大器将血细胞微弱脉冲信号放大以触发电路系统。阈值调节器调节能区分不同群细胞合适的信号电平。,甄别器去除非参考电平的各种假信

4、号以提高计数的准确性。整形器将不一致的脉冲波形信号调整为标准的波形后触发计数电路系统。计数系统 将整形后的血细胞脉冲信号显示为不同类群的细胞数。,二、激光散射法,激光散射法应用了流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测原理。流式细胞术检测原理：细胞通过激光束被照射时，产生与细胞特征相应的各种角度的散射光。对经信号检测器接收的散射光信息进行综合分析，即可准确区分正常类型的细胞。,P94,低角度散射光（前向散射光）：反映细胞的数量和表面体积大小。高角度散射光（侧向散射光）：反映细胞的内部颗粒、细胞核等复杂性。,P94表3-1,激光散射法在区别体积相同而类型不同的细胞特征时，比电阻抗法

5、分群更加准确。故激光散射法已成为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一。,流式细胞仪的技术特点,流式细胞仪在设计上采用了许多独特的技术，比如液流系统、光路系统、信号测量和细胞分选方面都有自己的技术特点。鞘流原理,雷诺系数 ReRed/d:管子的直径：液体的密度：液体的流速：液体的粘滞系数Re2300，液流处于湍流状态,通常把标本流的流速控制在10m/s以内，就能保持标本流处于稳流状态。外面包被有高速流动的鞘液，实现标本与鞘液稳定的同轴流动状态。同时利用液流聚焦原理，使标本流直径变小，通常只有1020m，避免细胞多个重叠进入检测区。,激光散射法系统基本组成,1、光源气体（氦氖）激光或固体（半导体

6、）激光（单色光）；钨光源（多色光）。2、鞘流维持颗粒于液流中央，顺序、单个、恒速向前流动，即流体动力学聚焦。,3、细胞悬液被检测细胞（颗粒）的悬液，由气压导入流动池。4、光检测器接受来自各种角度的散射光或吸收光信号，并转换成相应特征的电信号,三、射频电导法,射频（radio frequency,RF)指射频电流，是每秒变化大于10 000次的高频交流电磁波。高频电流能通过细胞壁。用高频电磁探针渗入细胞膜脂质可测定细胞的导电性，提供细胞内部化学成分、细胞核和细胞质、颗粒成分等特征信息。,P94,四、分光光度法,分析仪检测Hb 的原理：被稀释的血液加入溶血剂后，红细胞溶解，释放血红蛋白，后者与溶血

7、剂结合形成Hb衍生物，在特定波长（530550nm）下比色，吸光度的变化与液体中Hb含量成比例。,P96,血红蛋白,血红蛋白衍生物,吸光度,Hb浓度,540nm,溶血剂,血液分析仪检测参数原理,一、白细胞系列参数检测原理,根据电阻抗的原理，不同体积白细胞(35-450)fL产生脉冲大小的明显差异而区分相应的三群细胞：,3590f1,160fl以上,90160f1,（一）电阻抗法,仪器将体积为35450fL的血细胞，分为256个通道（channel）。每个通道：1.64fl。根据细胞大小，分别置于不同的通道中，显示血细胞体积分布直方图(Histogram)。,1.分群,经溶血素处理脱水后，血细胞

8、体积大小发生了变化！白细胞通透性改变，胞质渗出胞膜紧紧裹在核或存在颗粒周围第一群（3590fl）小细胞区：淋巴细胞（体积最小）。第二群（90160fl）单个核细胞区，（中间细胞）：单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始、幼稚细胞、异常细胞等。第三群（160fl以上）大细胞区：嗜中性粒细胞（体积最大）。,2.白细胞分布直方图,三分群血液分析仪正常白细胞分类模式图（直方图）,%,血细胞直方图,1 血细胞直方图概念：在细胞通过小孔计数时，感应器收集脉冲 的大小及数量，转换为相应的细胞体积和数量，并在坐标上表示出来。坐标的横轴(x)代表体积(FL)，纵轴(Y)代表相对数量，将各点用光滑的 曲线相连

9、，就是直方图。即直方图是可以表示 出细胞群体体积分布情况的图形。,P106,（二）光散射法白细胞分类,激光与细胞化学法容量、电导、光散射（VCS）法电阻抗与射频法多角度偏振光散射法,体积、电导和光散射法（volume,conductivity,light scatter,VCS),V C S,电阻抗技术,细胞大小和内部结构,细胞内的颗粒性、核分叶性和细胞表面结构,P96,VCS法原理,1 应用电阻抗原理测量细胞体积(Volume，V)技术。2 应用电导性（Conductivity C）技术。检测的原理是：根据细胞壁能产生高频 电流的性能，采用高频电磁探针，测量 细胞内部结构，即以细胞核和细胞质

10、的 比例、细胞内颗粒的大小和密度，来辨 别体积相同、但性质不同的两个细胞群 体，如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞。,VCS法原理,3 应用光散射(Light scatter，S)技术。原理是：来自激光源的单色光直接扫描 进入计数敏感区的每一个细胞，根据细 胞产生不同角度的散射光(10一70)，可提供细胞形态、核结构等光散射信息，并能鉴别细胞颗粒的构型和质量，光散 射可区别粒细胞(中性粒细胞、嗜碱性 粒细胞、嗜酸性粒细胞)的类型。,体积 电导 光散射,P97图,VCS技术的代表机型,Coulter公司的STKS型、MAXM 型以及Gen.s型五分类血液分析仪,2.多角度偏振光散射法（MAPSS),（1）

11、白细胞计数 用含DNA染料碘化丙啶试剂可破坏有核红细胞膜和细胞质，只留下细胞核，裸核易于染色。染料对有活性的白细胞只有极小渗透性或无渗透性，故不出现细胞核染色。从而鉴别有核红细胞和活性白细胞，计算活性白细胞比率。,P99,（2）白细胞分群,MAPSS,0,前向散射光：细胞大小、数量,7，侧向散射光：细胞内部结构及核染色质的复杂性,90，垂直角度散射光：细胞内部颗粒及分叶状况,90D，垂直角度去偏振散射 光，鉴别E与N,MAPSS法可鉴别白细胞亚群、异常细胞类型，白细胞分类不受有核红细胞干扰物质影响。,成熟红细胞系列参数检测原理,电阻抗法红细胞检测原理,电阻抗法检测红细胞要注意白细胞增高干扰：稀

12、释血液中含有白细胞，当血液进入红细胞 检测通道时，红细胞检测的各项参数中均含 有白细胞因素。正常时，血液红细胞与白细 胞的比例约为500：1750：l，因此，白细 胞因素可忽略不计。当病理情况下，如白血病时，白细胞数明显 增高，同时又伴有贫血时，使所得红细胞参 数可产生明显误差。,红细胞体积分布直方图,P108,在36-360fl范围内分析红细胞，正常红细胞主要分布在50-200fl。正常直方图上可见两个细胞群体：50-125fl区域有一个几乎两侧对称、较狭窄的正态分布曲线；主峰右侧约在125-200fl区域的细胞，为大红细胞和网织红细胞。,（二）流式细胞术光散射法,1、光散射法红细胞、血红蛋

13、白检测原理 低角度(23)：测量红细胞体积。高角度(515)：测定红细胞血红蛋白浓度。,2、红细胞散点图 是红细胞体积与血红蛋白浓度二维散点图，反映光散射与细胞体积和血红蛋白浓度之间的相互关系，能准确区分小红细胞等异常。线性体积/血红蛋白浓度（V/HC)散点图分为9个区。,P108,血红蛋白测定原理,分光光度法,有关溶血剂,ICSH（international council for standardization in haematology国际血液学标准化委员会）推荐的氰化高铁血红蛋白法：最大吸收峰在540nm。试剂反应时间长，5分钟，不适合全自动仪器。另外，氰化血红蛋白（CN-HB）：试

14、剂成分氰化钾（剧毒）。2 非氰化溶血剂：HICH-HB吸收光谱相似。避免试剂对检验人员的潜在危害和对环境的污染,10 血小板检测原理,根据电阻抗法，血小板随红细胞在一个系统中进行检测，在红细胞血小板计数池中计数2fl30fl的颗粒。,10 20 30(fl),血细胞分析仪的类型,对白细胞分析程度二分群三分群五分类自动化程度：半自动仪器须手工稀释标本全自动仪器可直接用抗凝血进样,全自动三分群血细胞分析仪,一、仪器性能1.检测速度6080个/h,可连续吸取样本2.两种溶血素，即白细胞溶血素和红细胞溶血素SLS-Hb法（无毒）3.仪器线性范围宽、重复性好、准确性高、变异范围小4.自动化程度高,有自动

15、报警系统。5.有质控资料及标本检测资料贮存等软件程序。,2.检测项目 WBC；N#;N;L#;L;MID#;MID;RBC;Hb;HCT;MCV;MCH;MCHC;RDW-SD;RDW-CV;PLT;PDW;MPV;P-LCR;PCT3.代表仪器：CD-1700、Coulter ONYX血细胞分析仪等。,P102表,全自动五分类血细胞分析仪,1.仪器性能速度快，每小时110150个标本。具有检测有核红细胞的功能。专用幼稚细胞检测通道和试剂。多种分类技术的使用使白细胞分类更加精确，达到最低分类镜检率。强大的网络功能及完善的数据管理系统，可开展远程诊断，远程维护和质控提供软件支持。高效、自动的标本

16、资料管理及强大的工作平台。无错进样管理，包括穿刺进样，条码识别和双重样本完整性探测器。,2.检测项目 M;M#;E#;E;B;B#;未成熟白细胞NRBC;RET;IPF3.代表仪器 SF-3000血细胞分析仪、EXCELTM22血细胞分析仪等。,仪器方法学评价,仪器类型和特点仪器性能的评价影响直方图变化的因素,（一）仪器类型和特点,（一）仪器类型和特点 1单纯电阻抗法三分群血液分析仪特点(1)检测参数：约20项左右。(2)白细胞分类：只能对白细胞进行三分群。(3)直方图：3种直方图。(4)报警功能：以文字和(或)图标提示 异常检测结果的信息。,（一）仪器类型和特点,2.综合光学和电学等技术血液

17、分析仪特点(1)检测参数：约20至40项左右(2)白细胞分类：能对白细胞进行五分类。(3)直方图和散点图：3种直方图和散点图。(4)报警功能：以文字和(或)图标显示 异常检测结果的信息。注意：各类型血液分析仪不具备识别异常细胞 形态的能力，故不能完全代替镜检。,（二）仪器性能的评价,ICSH公布的对血液分析仪评价方案：1 可比性 2 准确性 3 总重复性 4 精密度 5 线性范围,P116,仪器性能的评价的基本概念,1.准确度(accuracy)和精密度(precision)(1)准确度是指测定值和真值之间的密切程度，准确度只能用参考物来核对，参加室间质量 评价是另一种确认准确度的好方法。(2

18、)精密度指结果的重复性，由标本进行重复试验来衡量。重复n次（最好31次）。计算标准差和变异系数。,关于准确度和精密度的注意点,质量是检验工作的生命线，首先应保证实验 结果的准确度和精密度在可接受范围内。2 结果可以重复称为精密，但可以高度不准确。精密度可以观察到波动，如更换试剂时，可由质控图反映出结果的波动情况。,标准物、参考物,1 标准物是一种化学物质或物理材料，具有 唯一的指定值，是代表国际或国家的参考 标准。国际参考标准是国际组织(如WHO或 ICSH)决定的，可用于国家参考物或校准 物的控制，由于其生产量有限，不可能在 常规工作中使用。2 参考物是一种物质(如参考血浆)或材料(如参考滤

19、光片)，符合国家或国际参考标 准，可用于保证常规检测工作的准确性。,质控物、校准物,校准物是一种物质或材料，符合标准物的性 能，适用于校准仪器或调整测量值，以获得 准确结果。质控物是一种物质(如质控血浆)，适用于核 查常规检验的精密度。它必须和病人标本同 样分析，也适用于核查结果的准确性。有时 候，质控物和校准物一样能用于检查结果的 准确度，但必须能提供和校准物同等的性能 资料。,线性范围,评价仪器测定值与稀释倍数是否呈 比例关系，可求出仪器的最佳线性范围。,五 临床应用,1 检测参数临床意义红细胞参数白细胞参数血小板参数2 三种直方图的临床应用,P120,细胞直方图作用,为临床提供直观的检验

20、结果。为检验人员监控仪器工作状态及检测 结果提供了直观的图形。,P107,正常血小板直方图,正常血小板直方图呈左偏态分布：230fl分布，主要在215fl。,异常血小板直方图,峰右移,左右侧起点较高,异常血小板直方图,右侧呈脱尾状,峰左移,直方图的临床应用,(二)红细胞直方图在贫血中的应用 不同贫血红细胞体积的变化，使红细胞 体积分布图形发生变化，结合其它参数对 鉴别诊断颇有价值（根据MCV和RDW可对贫 血进行分类）：1 小细胞性贫血 2 大细胞性贫血 3 正细胞性贫血,红细胞直方图有关的两个参数,红细胞直方图有关两个参数是MCV，RDWMCV表示红细胞平均体积，MCV变大，红细胞峰右移；M

21、CV变小，红细胞峰左移。,2 RDW,RDW由血细胞分析仪测量获得，它的统计学实质是红细胞大小的变异系数(CV)。当红细胞通过小孔的一瞬间，计数电路得到一个相应大小的脉冲，不同大小的脉冲信号分别贮存在仪器内装计算机的不同通道，计算出相应的体积及细胞数，统计处理而得RDW。在MCV相似的情况下，RDW越大，红细胞峰就 越宽。,红细胞体积分布直方图,P108,正常红细胞主要分布在50-200fl,50-125fl区域有一个几乎对称的峰值,小细胞性贫血,RDW正常 RDW,MCV,大细胞性贫血（RDW正常）,溶贫白血病前期再障巨幼贫,大细胞性贫血（RDW轻度）,见于叶酸，维生素B12缺乏引起的巨幼贫,大细胞性贫血（RDW明显）,见于巨幼贫叶酸，维生素B12治疗初期,正细胞性贫血（RDW正常）,见于慢性病急性失血骨髓纤维化骨髓发育不良,(三)白细胞直方图的临床应用,白细胞直方图的变化，可评价血液中白细 胞群体的变化，但这种变化的细胞图并无特异 性，某一类白细胞的增多或减低均可使直方图 产生相似的变化。因此，异常白细胞直方图只能提示白细胞 分群之间比例变化或可能出现异常细胞，故要 求用显微镜复查血涂片。,异常白细胞直方图,急白一个高大细胞峰,异常白细胞直方图,重点,检测原理（库尔特原理）检测参数血细胞直方图临床应用（MPV MCV RDW，直方图）,