环境毒理学(董国日)05-1环境毒理学常用实验方法.ppt
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1、第五章 环境毒理学常用实验方法,第一节 急性毒性实验 第二节 蓄积毒性实验第三节 亚慢性和慢性毒性实验第四节 致突变试验第五节 致畸试验第六节 致癌试验,研究方法 流行病学研究 受控的临床研究 毒理学体内试验 毒理学体外试验优点 真实的暴露条件 规定的限定暴露条 易于控制暴露条件 影响因素少,易于控 在各化学物之间发生相 在人群中测定反应 能测定多种效应 制 互作用 对某组人群(如哮喘)能评价宿主特征的作用 可进行某些深入的研 测定在人群的作用 的研究是有力的(如:性别、年龄、遗 究(如:机制,代谢)表示全部的人敏感性 能测定效应的强度 传特征等和其他调控因 人力物力花费较少 素饮食等)能评价
2、机制缺点 耗资、耗时多 耗资多 动物暴露与人暴露相关 不能全面反映毒作用 多为回顾性,无健康 较低浓度和较短时 的不确定性 不能作为毒性评价和 保护 间的暴露 受控的饲养条件与人的 危险性评价的最后依 难以确定暴露,有混杂 限于较少量的人群 实际情况不一致 据 暴露问题(一般50)暴露的浓度和时间的模 难以观察慢性毒作用 可检测的危险性增加必 限于暂时、微小、式显著地不同于人群的 需达到2倍以上 可逆的效应 暴露 测定指标较粗(发病率,一般不适于研究最 死亡率)敏感的人群,毒理学研究方法的优缺点,1 实验动物和人对外源化学物的反应敏感 性不同,有时甚至存在着质的差别2 高剂量向低剂量外推的不确
3、定性3 小数量实验动物到大量人群外推的不确 定性4 成年健康动物向年老体弱及患病个体外 推的不确定性,实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的安全性时的不确定性,1 化学物在实验动物产生的作用,可以外推 于人。基本假设 人是最敏感的动物物 种;人和实验动物的生物学过程与体重(或体表面积)相关。2 实验动物必须暴露于高剂量,这是发现对 人潜在危害的必需的和可靠的方法。3 成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物和 人可能的暴露途径是基本的选择。,描述毒理学试验的基本原则,1 受试物毒作用的表现和性质 2 剂量反应(效应)研究 3 确定毒作用的靶器官 4 确定损害的可逆性,毒理学毒性评价试验的基本目的
4、,实验动物(laboratory animal)指经人工培育,对其携带微生物实行控制,遗传背景明确,来源清楚,可用于科学研究的动物。,实验动物的选择,实验动物的选择,物种选择 1 选择对外液化学物的毒性反应及代谢特点与人类接近的物种;2 选择自然寿命不太长的物种;3 选择易于饲养和实验操作的物种;4 选择经济并易于获得的物种。,近交系动物 连续20代以上兄妹交配或亲子交配培育突变系动物 突变的基因可世代相传并保持遗传基因特性杂交群动物 两个不同近交系之间有目的进行交配,所产生的第一代动物,亦称杂交一代动物。封闭群动物 5年以上不从外部引进新血缘,仅由同一品系的动物在固定场所保存繁殖的动物群,实
5、验动物的选择,品系选择,无菌动物 体内外均无任何微生物和寄生虫无特定病原体动物(SPF)体内无特定微生物和寄生虫存在的动物(无传染病)。饲养于封闭的系统。清洁动物 与SPF的不同:抗体检查常有脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗体滴度,但不应有临床症状、病理改变及自然死亡。饲养在半屏蔽系统。,微生物控制的选择,实验动物的选择,个体选择 1 年龄2 性别 3 生理状态 4 健康状况,实验动物的选择,品 系周龄 Wistar SD雌性雄性雌性雄性 354565052 4919786101 5134134130150 6166187172206 7209233210262 8214297240318 923
6、232525836510246370272399,大鼠体重与周龄的关系,小鼠体重与周龄的关系 品 系 周龄 昆明 BALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 01.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 15.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 27.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 313.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 421.35 22.6011.6012.4512.2012.5715
7、.7519.00 527.90 33.2514.7516.1016.9018.1020.7522.58 632.80 39.2515.6017.4018.4020.5021.8825.96 734.70 39.9016.1018.6519.0021.6023.1227.96 834.80 40.0518.1620.2520.2522.4024.1628.83,1 未处理对照组(空白对照组):本底值,质量控制2 阴性(溶剂赋形剂)对照:与染毒组比 较的基础 3 阳性对照:检测试验体系的有效性4 历史性对照:检查试验体系的稳定性,即进行实验室质量控制和保证,毒理学试验常用对照,对各个毒理学试验应该
8、用同一种、同一批号受 试物 受试物成分和配方必须固定 如是异构体混合物,异构体比例必须固定 活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度也 应固定 受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性 必须进行研究并报告 受试物应一次备齐全部实验的用量,受试样品,毒理学试验设计的统计学要求 随机、重复、对照原则 对常规毒理学试验资料的统计学方法 计量资料:一般用t检验或ANOVA 记数资料:卡方检验,毒理学试验的统计学,1 处理组与对照组比较差别有无显著性 2 有无剂量-反应关系3 是否伴有其他相关参数的改变4 是否在“正常”值范围,实验结果的判断,第一节 急性毒性试验一、急性毒性试验的目的:1、确定供试化学物
9、急性毒性的剂量反应关系和中毒特征;2、求LD50或LC50,为急性毒性评价提供依据。3、研究毒物的毒动学和毒效学过程。,表示急性毒性大小:LD50(对受试物的个体感受性影响较小,有更高的重现性),二、试验程序与评价 1动物选择:首选受试物在体内代谢情况与人体内相近的或对受试物最敏感的品系。一般:以哺乳动物为主,常用大鼠、小鼠;经皮:兔、豚鼠、猪 应对两种性别、成年和幼年动物进行测定。选择两种以上的实验动物,最好一为啮齿类,一为非啮齿类。(目的:核对种间差异),2染毒途径与方式:一般与人的接触途径相同。(1)经口染毒:常用灌胃法,也可将受试物放在饮水中由动物自由摄取。(2)经呼吸道染毒:将实验动
10、物放在有毒气或粉尘的染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒采用静式染毒瓶(柜),染毒24h。(3)经皮肤染毒:主要用于化学物经皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。正式给药前24h,背部脱毛,勿伤皮肤。将受试物均匀涂布于皮肤表面,用纱布覆盖,共敷24h。,3试验程序:(1)剂量与分组 预试验:找出受试物大致致死量范围(死亡率为10%90%);例:欲做化合物A的经口预试验。化合物B的化学结构与A相似,已知B的=LD50=40(预期毒性中值)。则预试验取2.5、10、40、160、640(上下各推12组,组距应较大,初始4倍差),求LD50正式试验:在LD100与LD0之间设57个剂量组。组距(对数)或 式中
11、:n-设计的剂量组数(2)症状观察 时间:24h或两周内的反应,三、LD50的计算与结果评价 计算方法:概率单位法和寇氏法。LD50值愈小,毒性愈大。,概率单位法,存在正态曲线关系。标准正态差d=(x-)/式中:x剂量对数;剂量对数均数 标准差,d=0,左边面积(死亡率)为50,右边面积(存活率)50 d=1,死亡率为84.13,d=2,死亡率为97.73,d2,死亡率接近100。d=一1,死亡率为15.87。d=一2,死亡率为2.27。d一3,死亡率接近0。,从上表,可以任一死亡率换算为相应的概率单位。,A:剂量对数死亡百分率B:剂量对数概率单位,LC50计算步骤如下:a.根据死亡率查概率单
12、位(死亡率为100或0不计)b.绘图求回归方程。c.求y=5的浓度对数(m),其反对数即为LC50,同理可得LC5、LC10、,d.求LC50的可信限 先求LC50的标准误差(Sm):S(校准差)=1/k 本例中:S=1/2.78,平均致死量法(又名寇氏法),试验要求:每个试验组动物数相同;各组剂量按等比级数分组;最大剂量的死亡率最好为100或与之接近,最小剂量的死亡率最好为0或与之接近。,式中:Xm最大剂量的对数值;i相邻剂量比值的对数;各组死亡率的总和(以小数表示)。,例小鼠腹腔注射致百虫急性毒性试验结果如下表所示,求 LD50,式中:p一个组死亡率;q一个组存活率;i相邻剂量比值的对数;
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