微生物的遗传和变异.ppt

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1、第七章微生物的遗传与变异,理想的工业用微生物菌种须具备：遗传性状稳定；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。,微生物的独特生物学特性：,（1）个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多

2、样性；（7）易于形成营养缺陷型；,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,研究微生物遗传学的意义,第一节遗传变异的物质基础,遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的

3、几率出现，（一般为10-610-10）；b.形状变化的幅度大；c.变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。,遗传遗传和变异是生物体的最本质的属性之一,1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 小鼠存活对小鼠注射活SIII菌小鼠死亡对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 小鼠死亡抽取心血 分离活的SIII菌,一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验,（一）经典转化实验（transformation）：研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：无荚膜，菌落表

4、面粗糙，无致病性,Griffith转化试验示意,混合培养,RII型活菌,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,SIII型活菌,健康,健康,健康,健康,健康,健康,健康,病死,病死,病死,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。,热死SIII菌不生长活 RII 菌长出RII菌热死SIII菌长出大量RII菌和10-6SIII菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,（二）噬菌体感染实验,A

5、.D.Hershey和M.Chase，1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,（三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病

6、斑中还能分离出正常病毒粒子。,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变突变（mutation）：指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,二、诱变育种,诱变育种的步骤：,原始菌种,纯化,

7、斜面/肉汤培养,单孢子/单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,诱变育种的基本过程：,选择选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验,1.出发菌株的选择：出发菌株用来育种处理的起始菌株出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力；出发菌株的来源；自然界直接分离到的野生型菌株：历经生产考验的菌株：已经历多次育种处理的菌株：,2.制备细胞悬液要求：菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag）;方法：玻璃

8、珠打散10-15min;加.3%吐温80（表面活性剂）用无菌脱脂棉过滤。制备：物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl)化学诱变剂缓冲液 浓度：细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,3.诱变处理：诱变剂的作用：提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080%）,4.菌种筛选,4.1 筛选方案：实际工

9、作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.,可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。,以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如

10、：lys-，bio-野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：lys+;bio+;原养型：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,4.2营养缺陷型(auxotroph)的筛选,与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基,基本培养基（MM）：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。完全培养基（CM）：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。补充培养基（SM）：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,缺陷型的浓缩：,抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生

11、长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。方法：将菌培养在含抗生素的MM基中,菌丝过滤法,适用于：丝状（放线菌、霉菌）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。,逐个检出法：,缺陷型的检出：,影印平板培养法,夹层培养法,生长谱法方法简便；回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片,缺陷型的鉴定：,测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；,缺陷型的应用,作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、研究代谢过程时用作亲本标记；作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；作为aa、维生

12、素、碱基的测定菌株。,第三节 细菌的基因重组,定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）或遗传重组。作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。重组与杂交的关系：重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexual hybridization）等及原核生物中的转化、转导、接合和原

13、生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。,甲生长快、产量低,乙生长慢、产量高,基因重组,如：,生长快、产量高,细菌的基因重组,基因重组的方式转化转导接合原生质体融合,R型活菌+S型死菌 S型活菌定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。有关名词：受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者供体菌：donor，转化基因的提供者转化因子：来自供体菌的DNA片段转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色

14、体组的重组子,（一）转化（transformation）,1、转化及其发现：,受体细胞要处于感受态.感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右 菌株间的亲缘关系密切,2、转化发生的条件：,3、转化的类型：,根据感受态建立的方式，可以分为：自然遗传转化natural genetic transformation人工转化artificial transformation,转化因子：,转化因子：本质是供体DNA片段一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认为线状单链DNA也有转化

15、作用。大小：经过多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1107，即约占细菌核染色体组的0.3%，其上平均约含15个基因。而粗制的DNA则分子量较大。,.转化的过程,以肺炎链球菌抗链霉素菌株为例，分为六阶段：吸附：双链DNA片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合。在吸附过程的前阶段，如外界加入DNA酶，就会减少转化子的产生。稍后，DNA酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的DNA片段；入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它

16、提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；,重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，发生交换、整合和取代，形成杂合DNA区段（heterozygous region）。复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,.转化的过程,降解,吸附,切割成45106,单链入胞,同源部分配对、整合,复制分裂，只有一个子代DNA分子获得供体基因,转化的过程,strr,strr,人工转化,人工转化是通过人为诱导的方法，使细胞

17、具有摄取DNA的能力，或人工地将DNA导入细胞内。方法：CaCl2处理细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状态.电穿孔法electroporation：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括DNA）能通过这些小孔进入细胞。,Try-his+,Try+his-,Try+his+,混合培养,A,B,二、转导（transduction）,J.Lederberg等（1952）在Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。,1.转导及其发现,定义：以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现

18、象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。,2.转导的种类,完全普遍转导 普遍转导 流产普遍转导 转导 低频转导 局限转导 高频转导,过程：供体菌 正常噬菌体+完全缺陷噬菌体 少量裂解物+大量受体菌 遗传稳定的转导子,（1）普遍性转导（generalized transduction）,定义：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。1.1完全(普遍性)转导：complete transduction。1952年发现，在Salmonella typhimurium中存在转导现象。在它的完全普遍性转导实验中：以其野生型菌株

19、作为供体菌营养缺陷型菌株作为受体菌P22噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体,完全普遍转导,噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1）包入的完全是噬菌体的DNA（正常噬菌体）2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体）3）部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体）转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。,噬菌体裂解第一个宿主,一个稳定的转导子的形成,第一次交换第二次交换交换完成，外源DNA掺入染色体组中,1.2流产普遍性转导（abortive transduction）,概念：受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录

20、和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释。,流产转导示意图,所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。,2.局限性转导,定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约10

21、 5）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）,普遍性转导和局限性转导的比较,三、接合（conjugation）,定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长度的DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）研究方法：1946年J.Lederberg等采用E.coli的两株营养缺陷型进行实验，奠定了方法学基础；也为以后的微生物遗传学提供了必要的条件。,接合两个亲本细胞通过直接接触来转移遗传物质的基因重组方式

22、。通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）1946年用E.coli的两个营养缺陷型所作的实验：,1、接合及其发现,A,B,研究细菌接合方法的基本原理,U型管实验：,接合：供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递DNA，在受体细胞中发生交换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。,F因子的存在方式,根据F因子在E.coli中的有无，及与染色体的关系，可将E.coli分为四种类型：,F（“雌性”）菌株：细胞中不含有F因子，细胞表面不具有有性纤毛。可以通过与F+、F或Hfr菌株接合而接受供体菌的F因子、F因子或Hfr菌株的部分或全

23、部遗传信息，相应地可以转变成F+菌株、F菌株或重组子。据估计，从自然界分离到的2000株E.coli中约有30%是F菌株。,F+（“雄性”）菌株：细胞内含有（14个）游离的F因子，细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。与F 相接触时，可通过性菌毛将F因子转移到F 细胞中，使之也变成F+菌株。F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。,Hfr（高频重组，high frequency recombination）菌株：含有与染色体特定位点整合的F因子。因该菌株与F 接合后的重组频率比F+菌株高几百倍而得名。Hfr菌株与F菌株接合时，Hfr染色体双链中的一条单链在F因

24、子处发生断裂，F因子位于线状单链DNA的两端，整段单链线状染色体从5端开始等速进入F细胞，在没有外界干扰的情况下，全部转移过程的完成需要约120分钟。由于种种原因DNA转移过程常会发生中断，所以越是前端的基因进入F 细胞的机会越大。F因子位于线状DNA的末端，进入受体细胞的机会最小，故这种接合引起转性的频率最低，但可以出现各种重组子。,F菌株：细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状F因子，可与F 菌株接合，使其成为F菌株。F菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切离而脱离核染色体组时所形成，并因此造成细胞染色体发生缺失，F因子也缺失一段DNA.F因子转导F-mediated transd

25、uction:利用F菌株与F接合可将供体染色体DNA传入F 菌株，从而使F 既获得供体菌的若干遗传特性，又可获得F因子。这种接合方式叫做F因子转导,又称性导sexduction.因为F因子可在细菌的染色体多位点整合，所以F因子转导可实现不同基因的转移和重组。,F F F+F,F因子转导（F-duction）：,通过F菌株与与F菌株间的接合，就可以使后者转变成F菌株。它是一个部分双倍体，具有一个不完整的F因子，缺少部分基因，仍可进行与F菌株间的接合。由F因子来传递供体基因的方式，称为F因子转导、性导或F因子媒介的转导。,四、原生质体融合protoplast fusion,概念：通过人为方法，使遗

26、传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（fusant）的过程，称为原生质体融合。适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。意义：70年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。发展点：有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目前还在探索中。,原生质体融合的优点：可以提高重组率 双亲可以少带标记或不带标记 可进行多亲本融合 有利于不同种间

27、、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量,原生质体融合的主要步骤：,选择亲株制备原生质体原生质体融合 原生质体再生筛选优良性状的融合重组子,一、菌种的衰退与复壮的概念1.衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。衰退的原因：基因突变，分离现象。常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,第四节 菌种的衰退、复壮及保藏,2、菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。

28、狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）；淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。,3、防止菌种衰退的方法：控制传代次

29、数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；选择合适的培养条件；采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；采用有效的菌种保藏方法。,二、菌种保藏：1.原理：挑选优良菌种，人工创造低温、干燥、缺氧的环境条件，使微生物菌种的代谢活动处于最不活跃的休眠状态以达保持纯种的目的。2.目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种,不杂、不乱、不衰、不退,3、方法：斜面低温保藏法原理：低温方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上适温培养至生长完全4冰

30、箱保藏每隔一段时间移接一次说明：适于生产和科研中经常采用的菌种；保藏时间：霉 4个月 酵46个月 放 3个月 细 12个月 培养基应少含或不含糖分（尤以细菌）试管密封以隔绝空气优：方法简单，成活率高缺：保存时间短，传代次数多，易变异。,石蜡油封藏法原理：低温、缺氧方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管内（油量高出斜面1cm）包扎后竖直放入冰箱保藏。说明：液体石蜡于170干热灭菌1h。斜面培养基能干燥则保藏效果好。保藏时间12年。适于保藏霉菌、酵母、放线菌及芽孢杆菌。能同化烃类的微生物不宜用此法。,砂土管保藏法原理：干燥、缺氧方法：取河砂若干，24目过筛10%HCl浸泡24h水洗至中性烘干后

31、分装安瓿瓶或试管，加棉塞1kg/cm、23分钟无菌检查每管加孢子悬液，接种环拌匀干燥器中干燥火焰熔封或蜡封干燥器中保藏说明：适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌 时间210年,真空冷冻干燥法原理：低温、干燥、真空（缺氧）方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下快速冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的水分直接升华为水蒸汽，以达干燥的目的。常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖说明：目前最有效的保藏方法。适于细、放、酵、霉、病毒的保存。保存时间120年。存活率高、变异率低，但手续麻烦，且需一定设备条件。,液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196）

32、。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,几种常用菌种保藏方法的比较,思考题,1、试比较转化、转导、结合现象。2、普遍性转导和局限性转导有何区别？3、F+、F、F和Hfr菌株有何区别？4、什么叫诱变育种？其主要步骤有哪些？5、什么是基因工程？其基本操作步骤是什么？6、何谓菌种退化、复壮？如何防止菌种退化？7、简述常用菌种保藏方法和原理。8、解释名词 转化 转导 接合 野生型 营养缺陷型 基本培养基 完全培养基,